NGF誘導PC12細胞分化晚期的蛋白質組學研究

侯 澍 張 磊 李紅杰 胡林森 (首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院神經內科，北京 0008)

NGF誘導PC12細胞分化晚期的蛋白質組學研究

侯 澍 張 磊1李紅杰2胡林森3(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院神經內科，北京 100038)

目的 研究神經生長因子(NGF)誘導PC12細胞分化晚期的細胞蛋白質組變化，探索NGF誘導細胞分化的分子機制。方法50 ng/m l NGF作用于PC12細胞96 h，提取細胞總蛋白，應用熒光差異凝膠電泳(DIGE)獲取蛋白點的差異表達信息，運用MALDI-TOF質譜鑒定出差異蛋白質。結果 NGF誘導96 h后，共有58個蛋白點發生變化，質譜鑒定出了10種蛋白。結論 本實驗首次應用DIGE技術篩選NGF誘導PC12細胞分化晚期的相關蛋白，其中5種蛋白是首次在NGF誘導的PC12細胞中被報道。這些蛋白可能是NGF信號轉導過程的新成員，也可以成為藥物治療的新靶點。

蛋白質組學;DIGE;NGF;PC12細胞

神經生長因子(NGF)是最早被發現和分離純化的多肽生長因子，是神經營養因子(NT)家族的典型代表。本研究應用蛋白質組學技術篩選NGF誘發PC12細胞分化的相關蛋白，旨在尋找NGF信號轉導過程的新成員，為深入進行神經保護藥物的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫，DMEM購自Gibco公司，NGF購自廈門北大之路生物工程有限公司。尿素、硫脲、CyDye熒光標記物(Cy2，Cy3，Cy5)、賴氨酸、24 cm固相pH梯度干膠條pH3-10NL、甘油、SDS、IAA等均購自GE Healthcare-Biosciences公司。Ultrospec 3300 pro分光光度計、Ettan DALT Six電泳系統、Typhoon 9400系列多功能激光掃描成像系統以及基質輔助激光解析/電離-飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)均由GE Healthcare-Biosciences公司提供。

1.2 NGF誘導PC12細胞分化晚期模型的建立 DMEM培養基中含體積分數為10%新生牛血清、1%谷氨酰胺、100μg/ml青霉素、100μg/m l鏈霉素，PC12細胞于37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞長至90%接觸時進行傳代，選取對數生長期細胞進行實驗研究。

將細胞按1×105個/ml密度接種，實驗組中加入50 ng/ml NGF、對照組中加入等體積培養液。給藥后96 h進行吖啶橙和溴化乙啶染色，觀察細胞形態變化，并計數分化的細胞(每孔隨機計數300個細胞，其中突起的長度超過胞體直徑2倍者計為陽性，長出多個突起的細胞只計數1次，至少計數3個孔)。

1.3 蛋白質組學分析和差異蛋白質的鑒定 選取四批不同代數的細胞，設為實驗組(T1～4)和對照組(C1～4)，實驗組中加入50 ng/m l NGF、對照組中加入等體積培養液，再培養96 h。收取細胞蛋白質，純化后定量。T1～4、C1～4各取50μg分別放入8個離心管中;再取T1～4、C1～4各25μg制成內標。如表1所示進行分組，分別以1μl CyDye(Cy3、5)工作液標記相應的蛋白樣品，用4μl Cy2工作液標記內標。分組后，按既定程序進行雙向電泳，然后進行凝膠圖像掃描與分析。

表1 樣品分組及內標構成

同樣的方法進行制備膠的電泳，然后應用考馬斯亮藍染色及MALDI-TOF-MS質譜儀進行蛋白質的鑒定。

2 結果

2.1 NGF作用96 h PC12細胞的形態學變化 見圖1。NGF作用后觀察PC12細胞形態學的變化，并與對照組進行比較。NGF作用96 h后，細胞變得扁平，呈梭形或多角形，胞體增大，48%的細胞長出長突起，不同細胞的突起可連接成網。顯微鏡下細胞計數，NGF作用96 h后實驗組陽性細胞約占細胞總數的48%，相應對照組陽性細胞約占2.4%。

圖1 對照組與NGF處理組PC12細胞的形態(吖啶橙和溴化乙啶染色，×200)

2.2 NGF誘導96 h的差異蛋白質組分析 雙向電泳之后，實驗組和對照組的蛋白質斑點分布模式基本一致，所獲12張蛋白質膠圖平均含有(2 234±76)個點。以Cy2圖像為標準，與其他各圖譜相匹配，匹配率約為88.1%。用軟件分析NGF誘導PC12細胞分化晚期(96 h)的蛋白質表達，發現實驗組與對照組相比有58個蛋白點表達量顯著改變，經過質譜鑒定，獲得其中10個蛋白質的明確質譜信息，見圖2、圖3及表2。其中NF-M、NF-L、α-tubulin 2、tubulin β-15、annexin Ⅴ、TM 等 6 個蛋白表達上調，而VCP、TH、RNA解旋酶、GST等4個蛋白表達下調。如圖2A所示點d的5個蛋白質點分子量相當，等電點間隔相同，而且各點的質譜鑒定結果完全一致，提示這一列蛋白點為發生不同程度修飾的同一蛋白。

圖2 NGF誘導PC12細胞96 h的蛋白質組學分析圖譜

圖3 蛋白點h的MALDI-TOF-MS鑒定結果

表2 NGF作用96 h后差異表達蛋白的質譜鑒定結果

3 討論

蛋白質組學技術的關鍵在于蛋白質的分離和鑒定，二維電泳(2DE)是目前分離蛋白質的主要手段，但是傳統的2DE技術靈敏度較低，結果可靠性、重復性較差。DIGE技術〔1〕在傳統雙向電泳技術的基礎上，結合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記的樣品，極大地提高了結果的準確性、可靠性和重復性，被認為是目前定量蛋白質組學研究中可信度和準確率最高的技術之一。

本實驗中，NGF作用PC12細胞96 h后，共發現58個表達量變化的蛋白點，質譜獲得其中10種蛋白質的明確信息。其中有5種結構蛋白，即 NF-M、NF-L、α tubulin-2、tubulinβ-15和TM，他們的表達均增高，參與構成微管、微絲及中間絲蛋白等細胞結構。

蛋白點 b為含纈酪肽蛋白(valosin-containing protein，VCP)，是三磷酸腺苷酶超家族中的一員，又稱黑色素轉鐵蛋白或p97。VCP的底物多樣〔2〕，包括有絲分裂的細胞周期蛋白以及細胞周期蛋白激酶抑制劑p27、原癌基因產物p53、c-myc、c-Jun、I-κB等。因而VCP在膜融合、細胞分裂周期調控、細胞內蛋白的運輸和調控以及細胞凋亡等活動中均發揮著重要作用。

蛋白點d被鑒定為TH，該酶是兒茶酚胺類神經遞質合成過程中的限速酶，催化酪氨酸轉變成L-多巴，膠質細胞源性神經營養因子能夠誘導中腦源干細胞表達TH〔3〕。有報道顯示，低濃度(1μg/ml)NGF作用早期，交感神經元內TH水平下降，此時NGF主要通過細胞表面受體促使軸突的形成;而高濃度NGF(100μg/ml)則通過神經末梢攝取和軸突的逆向轉運到達胞體，誘導TH表達和細胞生存〔4〕。本實驗應用的NGF濃度為50 ng/ml，遠遠低于引起TH表達所需的NGF濃度，推測這是TH表達下調的主要原因。

經質譜鑒定，蛋白點h為膜聯蛋白Ⅴ。膜聯蛋白具有抑制磷脂酶A2及蛋白激酶C活性、參與細胞骨架活動、參與磷脂化與膜受體的功能調節、抗凝、傳導有絲分裂信號以及促進細胞分泌等重要生理功能〔5〕。本研究中實驗組的膜聯蛋白Ⅴ表達顯著增高，其在NGF誘導PC12細胞分化過程中的具體作用還需進一步探索。

蛋白點g經質譜鑒定證實為RNA解旋酶，此酶能夠使雙鏈RNA解鏈，作用于RNA-蛋白復合體使其中RNA解離。細胞內RNA轉錄、加工剪接及核糖體組裝都需要解旋酶的參與〔6〕。本實驗在NGF誘導PC12細胞分化的蛋白質組學研究中檢測到RNA解旋酶的表達降低35%。推測此時ATP水解耗能減少，以節約能量用于細胞分化過程。

點j為GST Y-b亞單位，GST是細胞抗損傷、抗癌變的重要解毒酶系，主要催化還原型谷胱甘肽(GSH)與親電子化合物的結合，使后者失去結合DNA的活性，在代謝環境致癌物和化療藥物中發揮重要作用〔7〕。在本實驗中，檢測到GST含量降低，這可能與NGF誘導的PC12細胞分化過程有關。

綜上所述，本研究應用DIGE技術結合MALDI-TOF質譜分離鑒定了一批在NGF處理的PC12細胞中表達發生顯著改變的蛋白。這些蛋白可能是NGF信號轉導過程的新成員，也可以成為藥物治療的新靶點。

1 Yan JX，Devenish AT，Wait R，etal.Fluorescence two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry based proteomic analysis of Escherichia col〔i J〕.Proteomics，2002;2(12):1682-98.

2 Partridge JJ，Lopreiato JO Jr，Latterich M，et al.DNA damage modulates nucleolar interaction of the Werner protein with the AAA ATPase p97/VCP〔J〕.Mol Biol Cell，2003;14(10):4221-9.

3 姜 宇，曾水林，魯佑瑜，等.膠質細胞源性神經營養因子促進中腦源神經干細胞增殖和向多巴胺能神經元分化〔J〕.神經解剖學雜志，2010;26(5):537-42.

4 Hill CE，Hendry IA.Differences in sensitivity to nerve growth factor of axon formation and tyrosine hydroxylase induction in cultured sympathetic neurons〔J〕.Neuroscience，1976;1(6):489-96.

5 劉 懿，凌詒萍，鐘慈聲.annexin鈣依賴的磷脂結合蛋白在細胞分泌中的作用〔J〕.生理科學進展，1997;4:367-9.

6 Luking A，Stahl U，Schmidt U.The protein family of RNA helicases〔J〕.Crit Rev Biochem Mol Biol，1998;33(4):259-96.

7 Yang G，Shu XO，Ruan ZX，et al.Genetic polymorphisms in glutathione-S-transferase genes(GSTM1，GSTT1，GSTP1)and survival after chemotherapy for invasive breast carcinoma〔J〕.Cancer，2005;103(1):52-8.

Q503

A

1005-9202(2011)12-2267-03

1 吉林大學第二醫院兒科 2 長春市中心醫院神經內科

3 吉林大學第一醫院神經內科

胡林森(1949-)，男，教授，博士生導師，從事神經變性病的機制研究。

侯 澍(1978-)，女，醫師，博士，從事神經系統血管性疾病的機制和治療研究。

〔2010-10-20收稿 2011-02-25修回〕

(編輯 徐 杰)