缺氧對(duì)食管癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α及己糖激酶表達(dá)的影響

唐娜娜 朱宏 施瑞華

缺氧對(duì)食管癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α及己糖激酶表達(dá)的影響

唐娜娜 朱宏 施瑞華

目的探討不同缺氧程度對(duì)食管癌細(xì)胞株TE1中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)及糖酵解關(guān)鍵酶表達(dá)的影響。方法 TE1細(xì)胞分別在正常氧分壓和缺氧條件下培養(yǎng)，缺氧時(shí)間設(shè)定為6、12、24及48 h，使用Western blot方法檢測(cè)缺氧培養(yǎng)不同時(shí)間后細(xì)胞中HIF-1α及糖酵解關(guān)鍵酶己糖激酶II(Hexokinase-II，HK-II)的蛋白水平表達(dá)變化。結(jié)果常氧及缺氧條件下TE1細(xì)胞中HIF-1α及HK-II均有表達(dá)，缺氧后表達(dá)均較常氧培養(yǎng)時(shí)明顯增強(qiáng)，且隨缺氧時(shí)間不同而呈先增多后減少的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)論低氧能夠增加食管癌細(xì)胞中HIF-1α及HK-II表達(dá)而促進(jìn)糖酵解進(jìn)程，聯(lián)合抑制HIF-1α和糖酵解酶可能成為治療食管癌的潛在的靶點(diǎn)。

缺氧誘導(dǎo)因子-1α;糖酵解;食管癌

缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor，HIF-1α)是新近發(fā)現(xiàn)的與腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)密切相關(guān)的分子［1］，但其在細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制目前認(rèn)識(shí)還不一致。近年研究提示HIF-1α的表達(dá)及調(diào)控可能涉及糖酵解相關(guān)基因。為進(jìn)一步明確HIF-1α及糖酵解的調(diào)控機(jī)制，本研究擬觀(guān)察缺氧對(duì)HIF-1α及糖酵解的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 TE1細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所)，DMEM培養(yǎng)液;鼠抗人HIF-1α單抗;兔抗人HK-II;鼠抗人Tubulin-α單抗;HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗;HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗;

1.2 方法

1.2.1 食管鱗癌TE1細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TE1細(xì)胞貼壁傳代，后隨機(jī)分為正常氧分壓組和缺氧組，正常組置入含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱，缺氧組置入缺氧培養(yǎng)箱(37℃、1%O2、5%CO2、94%N2)，缺氧時(shí)間為 6、12、24、48 h，細(xì)胞裂解液收集各組細(xì)胞。

1.2.2 Western blot方法測(cè)定 HIF-1α、HK-II表達(dá) 取蛋白40μg上樣，行 SDS-PAGE電泳，冰浴電轉(zhuǎn)至NC膜，封閉后依次加入一抗(HIF-1α 1：500;HK-II 1：1000;Tubulin 1：4000)、二抗(羊抗鼠1：4000;羊抗兔1：4000)，ECL發(fā)光法曝光顯影。Tanon Gis軟件對(duì)感光膠片條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，組間差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

缺氧培養(yǎng)6、12、24、48 h 后，HIF-1α 及HK-II表達(dá)較常氧培養(yǎng)明顯升高(P＞0.05)，缺氧12 h表達(dá)到達(dá)高峰，隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)又逐漸下降(圖1)。

圖1 缺氧培養(yǎng)不同時(shí)間后HIF-1α、HK-II的蛋白表達(dá)情況

3 討論

缺氧誘導(dǎo)因子-1是一種核轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞在缺氧條件下維持氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵物質(zhì)［2］。HIF-1由α和β亞基組成，其活性取決于其α亞基。HIF-1α的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，本研究結(jié)果顯示，TE1細(xì)胞常氧狀態(tài)下即有HIF-1α表達(dá)，缺氧后表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白水平受環(huán)境氧濃度的高度調(diào)控。

惡性實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)迅速常造成腫瘤內(nèi)部微環(huán)境的缺氧狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞依賴(lài)糖酵解獲得能量的特點(diǎn)是其缺氧耐受的代謝基礎(chǔ)［3］。HK-II是影響糖酵解的關(guān)鍵基因［4］，本實(shí)驗(yàn)顯示低氧能夠促進(jìn)HK-II表達(dá)，從而促進(jìn)糖酵解進(jìn)程。

有學(xué)者提出PI3K/AKT通路是HIF-1α的主要調(diào)控機(jī)制［5］，而HIF-1α可調(diào)節(jié)糖酵解水平。通過(guò)本研究我們推測(cè)HIF-1α可能通過(guò)調(diào)控HK-II進(jìn)而影響糖酵解，聯(lián)合抑制HIF-1α和HK-II可能為腫瘤糖酵解途徑的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

［1］ Jie Hua，Rui-Hua Shi，Hong-Jie Zhang，et al.Effect of RNA interference-based silencing of HIF-1α gene on the expression of vasculogenic mimicry-associated genes in esophageal squamous carcinoma cells.World Chinese Journal of Digestology，2009(19)：1913-1918.

［2］ Matsuyama T，Nakanishi K，Hayashi T，et al.Expression of hypoxia-inducible factor-1α in esophageal squamous cell carcinoma Cancer Science，2005，96：3(176-182).

［3］ Pelicano H，Martin DS，Xu RH，et al.Glycolysis inhibition for anticancer treatment.Oncogene，2006，25(34)：4633-4646.

［4］ Airley RE，Mobasheri A.Hypoxic regulation of glucose transport，anaerobic metabolism and angiogenesis in cancer：novel pathways and targets for anticancer therapeutics.Chemotherapy，2007，53(4)：233-256.

［5］ Burrows N，Resch J，Cowen R.L，et al.Expression of hypoxia-inducible factor 1α in thyroid carcinomas Endocrine-Related Cancer，2010，17：1(61-72).

Influence of hypoxia on hypoxia-inducible factor-1α and Hexokinase-II in esophageal carcinoma

TANG Na-na，ZHU Hong，SHI Rui-Hua.Department of Gastroenterology，F(xiàn)irst Affilicated Hospital of NanJing Medical University，Nanjing 210029，Jiangsu Province，China

ObjectiveTo study the influence of hypoxia on hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α)and glycolysis associated protein in esophageal carcinoma TE1.MethodsEsophageal cancer TE1 were incubated under normoxic and hypoxic conditions for different time(6，12，24，48 h).Expressions of HIF-1α protein and the associated enzyme in glycolysis(HK-II)were detected by Western blot.ResultsHIF-1α and HK-II protein were both expressed in normoxic conditions.The expression of HIF-1α and HK-II increased after incubated in hypoxia environment，both reached perk at 12 h(P ＜0.05).ConclusionHypoxia condition can up-regulate the expression of HIF-1α and HK-II.Joint suppression of HIF-1α and key enzymes in glycolysis could become the potential targets for treatment of esophageal cancer.

Hypoxia inducible factor-1 alpha;Glycolysis;Esophageal cancer

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：30770991);國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：30800511)

210029南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院江蘇省人民醫(yī)院消化內(nèi)科

施瑞華