規(guī)?；i場豬鏈球菌的分離與鑒定

胡一飛 金俊杰 鄭潤俊 金大春

（1浙江省瑞安市畜牧獸醫(yī)局，浙江省瑞安市 325200；2溫州市畜牧獸醫(yī)局，浙江省溫州市 325000；3瑞安市畜牧獸醫(yī)局市區(qū)動物防疫所，浙江省瑞安市 325200）

規(guī)模化豬場豬鏈球菌的分離與鑒定

胡一飛1金俊杰2鄭潤俊3金大春2

（1浙江省瑞安市畜牧獸醫(yī)局，浙江省瑞安市 325200；2溫州市畜牧獸醫(yī)局，浙江省溫州市 325000；3瑞安市畜牧獸醫(yī)局市區(qū)動物防疫所，浙江省瑞安市 325200）

豬鏈球菌病是由多種不同群、不同血清型的鏈球菌引起的不同臨床癥狀的傳染病的總稱。因該致病菌有多達11個血清群致病，有限幾個血清群 （型）的疫苗，對此病的預防根本無濟于事。加上該病的耐藥性強，耐藥譜廣，抗生素治療經(jīng)常無效。當暴發(fā)此病時，常常無計可施，且其特征性癥狀主要以高熱和敗血癥為主，給人以高熱病的假象。一些專家認為鏈球菌對當前養(yǎng)豬業(yè)的危害已經(jīng)相當嚴重，并且很可能是近幾年愈演愈烈的無名高熱綜合征的主要病原[1]。本試驗通過對瑞安市規(guī)模化豬場進行豬鏈球菌的分離、鑒定及藥敏試驗，為預防和控制該病的流行提供了重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1病料來源

病料取自2007年9月至2010年5月在本市發(fā)生豬高熱病的7家畜牧場的發(fā)病豬。

1.1.2 細菌分離培養(yǎng)基

普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基、普通液體培養(yǎng)基。

1.1.3 試驗用品

細菌鑒定用的微量生化管、藥敏紙片、革蘭氏染色液、無菌綿羊血購自杭州天和微生物有限公司；試驗用的化學試劑購自化工市場，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 實驗小鼠和試驗兔

實驗用的小鼠和兔子購自溫州醫(yī)學院實驗動物中心，均為清潔級。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離純化

用接種針無菌取病豬心血、肝、肺組織分別接種到綿羊全血平板和普通固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，從平板上挑取單菌落再次進行純培養(yǎng)。

1.2.2細菌鑒定

對需進一步鑒定的純培養(yǎng)細菌進行涂片染色鏡檢，觀察其形態(tài)、大小及染色特性，移植于綿羊全血平板和普通固體培養(yǎng)基，進行生長觀察，并進行生化鑒定。

1.2.3生化試驗

用微量生化試驗管，按說明書操作進行生化試驗[2]。

1.2.4藥敏試驗

將分離鑒定好的菌株接種于綿羊全血平板，涂勻，選取相應抗生素的藥敏紙片貼于培養(yǎng)基上。于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，測量抑菌環(huán)直徑并判定結果。

1.2.5動物試驗

用分離的鏈球菌過夜培養(yǎng)液分別接種兔子 （耳靜脈注射1.5 mL+皮下分四點注射，每點0.5 mL），觀察其表現(xiàn)并測量體溫，記錄并連續(xù)觀察7天；用分離的鏈球菌過夜培養(yǎng)物分別接種小白鼠，每只0.2 mL腹腔注射，觀察其表現(xiàn)情況和死亡情況，記錄并連續(xù)觀察7天。

2 結果

2.1 細菌分離結果

對多個規(guī)模豬場送檢的病死豬樣品進行細菌學化驗，基本上每個發(fā)病豬場都分離到細菌，某些豬場首次送檢樣品時由于采樣前大劑量使用過抗生素而未分離到細菌，經(jīng)重新采樣，從流產(chǎn)、死產(chǎn)胎兒、新生仔豬或未使用過抗生素的患病個體采集，均成功分離出致病菌。

2.2 細菌培養(yǎng)結果

對13株分離菌進行鮮血瓊脂平板培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24小時后，共有10個菌株在鮮血瓊脂平板上形成表面光滑、灰白色、針尖大小、圓形、半透明、隆起的小菌落，并呈現(xiàn)草綠色溶血。單個菌落涂片染色后經(jīng)革蘭氏染色，普通光學顯微鏡下鏡檢，可見革蘭氏染色陽性、呈長鏈狀的球菌。其余3株菌落形態(tài)、溶血特征及單個菌落涂片染色鏡檢等不符合以上特征 （2株能在麥康凱平板生長的，一株為大腸桿菌、一株為沙門氏菌，另外一株鏡檢為葡萄球菌）。具體見表1。

2.3生化鑒定結果

對上述10株分離純化后的細菌進行生化鑒定，10株均符合豬鏈球菌的生化培養(yǎng)特性 （見表2），說明分離10株細菌為豬鏈球菌。

2.4 藥敏試驗結果

從藥物敏感試驗結果看，對大部分豬鏈球菌高度敏感的藥物有頭孢噻呋、頭孢噻肟等新藥；環(huán)丙沙星、先鋒V、頭孢拉定、新霉素、阿莫西林、氟苯尼考等為中敏藥物；林可霉素、壯觀霉素、強力霉素、復方新諾明、丁胺卡那等為低敏藥物，而牧場中最常用的青霉素G、鏈霉素、慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素、紅霉素、痢特靈等對大部分豬鏈球菌無效。

2.5 動物試驗結果

2.5.1兔子攻毒結果

用分離鏈球菌過夜培養(yǎng)液 （耳靜脈1.5 mL注射+皮下分四點注射，每點0.5 mL）接種10只兔子，接種后2小時內體溫逐漸上升，并超過1℃以上，維持2小時左右，以后一直緩慢下降，均于24小時內死亡。其中呼吸癥狀逐漸明顯，耳靜脈充血明顯。對死亡的兔子剖檢，病理變化幾乎相似，表現(xiàn)為：肺水腫，肺上有出血斑，肝腫大、腎有出血點，病料中均可分離到鏈球菌。

2.5.2小白鼠攻毒結果

鏈球菌過夜培養(yǎng)液接種小白鼠進行攻毒實驗，接種20只小鼠，每只小鼠腹腔注射培養(yǎng)物0.2 mL過夜，4小時后，扎堆、嗜睡較嚴重，并出現(xiàn)弓背、對外界反應遲鈍、呼吸急促、食欲減退、飲欲增加，24個小時內，有10只死亡，兩只瀕臨死亡。48小時全部死亡。對死亡的小白鼠剖檢，病理變化幾乎相似，表現(xiàn)為：肺水腫，肺上有出血，肝腫大。從死亡小鼠均可分離到鏈球菌。

3 討論

本次試驗從7家豬場分離到的13株細菌中，其中10株豬鏈球菌、1株葡萄球菌，1株沙門氏菌，1株大腸桿菌；說明鏈球菌是這些豬場細菌性疾病的主要病原之一。

通過本次的藥敏試驗可以看出，目前一般使用較少的頭孢類抗生素對豬鏈球菌病的控制和預防有一定的效果，而目前豬場經(jīng)常使用的藥物效果較差。因此建議豬場盡量根據(jù)本場情況，選擇合適藥物進行治療和預防。同時盡量輪換使用藥物，對低敏感的藥物直接停用半年以上。

經(jīng)過動物試驗明顯可以看出，此次分離的鏈球菌致病性較強，可以引起試驗動物發(fā)生持續(xù)高溫，并造成肺、肝、腎等多臟器出血、衰竭，這不僅是導致發(fā)生豬高熱病以后，出現(xiàn)高熱不退，多器官衰竭的主要原因，而且鏈球菌對林可霉素、壯觀霉素、強力霉素、復方新諾明、丁胺卡那等藥物具有很強的耐藥性，導致開始運用抗生素治療效果差。

[1]冷和平， 曾俊霞， 溫育銘， 李奎.七個豬場豬圓環(huán)病毒2型感染并發(fā)副豬嗜血桿菌病和鏈球菌病的綜合防治.豬業(yè)科學，2008（10）：80-83.

[2]姚火春.獸醫(yī)微生物學實驗指導 （第二版）.北京： 中國農(nóng)業(yè)出版杜，2002.114-118.