非離子氨和亞硝酸氮對蝦虎魚仔魚的急性毒性及安全濃度評價

林忠婷，李建軍，陳 琳，黃 韌

（廣東省實驗動物監測所，廣州 510260）

在循環水養殖系統中，隨著飼料等外界氮源的不斷加入，養殖水體中無機氮含量不斷積累，其濃度往往超過水生動物的耐受值，從而影響魚類生長速度，甚至導致死亡。養殖水體中的無機氮主要以非離子氨、銨態氮、亞硝酸氮和硝酸鹽氮的形式存在，其中非離子氨和亞硝酸氮的危害最大，是制約高密度養殖模式下魚類正常生長的主要因子之一。

裸項櫛蝦虎魚（Ctenogobius gymnauchen）為鱸形目、蝦虎魚亞目、蝦虎魚科、蝦虎魚亞科、櫛蝦虎魚屬的一種小型海洋魚類，為廣布暖溫種，分布于我國沿海，南至琉球、菲律賓一帶的礁石或沙泥底質淺水區。因其個體小，性成熟早，繁殖周期短，繁殖力強，便于實驗室內飼養管理，廣東省實驗動物監測所開展了一系列該魚的實驗動物化研究試驗［1-3］。魚類早期生命階段是其生命周期中對外界環境最敏感的階段，本試驗以裸項櫛蝦虎魚仔魚為試驗材料，研究了非離子氨和亞硝酸氮對魚類的急性毒性，旨在為制訂魚類實驗動物環境與質量標準提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

裸項櫛蝦虎魚仔魚，廣東省實驗動物監測所培育，第九代，7日齡，健康，其來源、孵化及培育參照GB/T 18420-2009《海洋石油勘探開發污染物生物毒性第2部分：檢驗方法》。

1.2 試驗藥品及溶液配制

試驗用氯化銨（NH4Cl）和亞硝酸鈉（NaNO2）為分析純，購自廣州化學試劑廠，試驗前用稀釋水分別配成4.147 mg/L非離子氨和10.88 g/L亞硝酸氮母液，試驗開始時用稀釋水稀釋成試驗所需濃度的暴露溶液。

1.3 試驗條件

試驗用稀釋水為天然海水，經水處理系統過濾和殺菌處理；試驗容器為250 m L燒杯，盛試液200 m L，隨機放入仔魚10尾；試驗期間用默克水質分析儀（MERCK，型號：NOVA60）監測非離子氨和亞硝酸氮含量，用溶解氧測定儀（YSI 550A）、酸度計（METTLER TOLEDO SevenGo SG2）、電導率儀（METTLER TOLEDO SevenGo SG3）等監測水質，試驗水溫（25±1）℃、溶氧（6.07～6.77） mg/L、鹽度30～31，pH8.0～8.2；試驗期間每尾魚每24 h投喂約500個褶皺臂尾輪蟲，每24 h更換試驗液一次。

1.4 試驗方法

首先根據非離子氨和亞硝酸氮對其它魚類毒性試驗的相關研究及預試驗結果設置5個濃度組和一個對照組，非離子氨濃度梯度設置為 0、0.413、0.735、1.309、2.329、4.147 mg/L，亞硝酸氮濃度梯度設置為0、3.0、4.14、5.713、7.884、10.88 g/L，每組設2個平行，暴露后觀察記錄仔魚中毒癥狀及死亡情況，及時撈出死亡仔魚。

1.5 數據計算

用概率單位法求出非離子氨（NH3）96 h LC50。

［4］，用下式計算其非離子氨濃度（CNH3）：

式中CT為總氨氮濃度；n NH3為非離子氨的物質的量；nN為氮的物質的量，海水 UIA％值查文獻［4］表4為 3.4％。即在本試驗中，CNH3=CT× 4.13％

參考文獻［5］，用下式計算安全濃度SC：

SC=0.1×96 hLC50

2 結果

2.1 中毒癥狀觀察

非離子態氨高濃度組（2.329 mg/L和 4.147 mg/L）和亞硝酸氮高濃度組（7.884 g/L和 10.88 g/L）中的仔魚在72 h后顯得呆滯，游動遲緩；80 h后出現側游；90 h后最高濃度組（非離子氨4.147 mg/L、亞硝酸氮10.88 g/L）部分仔魚呼吸困難、體色變白、身體彎曲，最后死亡。非離子氨組與亞硝酸氮組仔魚死亡情況有所不同，非離子氨組仔魚死亡時魚體大多從中間向內彎曲，仔魚從出現畸形到死亡的過程發展很快；亞硝酸氮各濃度組中的仔魚死亡前體色漸漸變白，仔魚從體色開始變化到死亡的過程發展較非離子氨組慢。

2.2 非離子氨和亞硝酸氮對裸項櫛蝦虎魚仔魚的96hLC50及安全濃度（見表1－4）

3 討論

3.1 非離子氨和亞硝酸氮的致毒機制

表1 非離子氨對裸項櫛蝦虎魚仔魚的急性毒性Tab.1 The acute toxicity of non-ion ammonia on larvae of Ctenogobius gymnauchen

表2 亞硝酸氮對裸項櫛蝦虎魚仔魚的急性毒性Tab.2 The acute toxicity of nitrite on larvae of Ctenogobius gymnauchen

表3 非離子氨對裸項櫛蝦虎魚仔魚的96 h LC50及安全濃度Tab.3 96 h LC50 and safe concentration of non-ion ammonia on larvae of Ctenogobius gymnauchen

表4 亞硝酸氮對裸項櫛蝦虎魚仔魚的96 h LC50及安全濃度Tab.4 96 h LC50 and safe concentration of nitrite on larvae of Ctenogobius gymnauchen

水環境中氨氮的主要來源是含氮有機物經細菌分解、氨化作用而形成的終產物，其次是水生生物排泄的含氮產物，它包含兩部分，即離子氨（）和非離子氨（NH3），統稱總氨或氨氮，其中非離子氨（NH3）是氨氮中主要毒物［5-9］。當水環境中非離子氨增加時，會抑制生物自身氨的排泄量，使血液和組織中氨的濃度升高，降低血液載氧能力；非離子氨（NH3）半徑較小，不帶電荷，為親脂性分子，很容易穿透脂質性生物膜的疏水性微孔進入生物體內，從而對鰓表皮細胞造成損傷，降低魚的免疫力，甚至直接使魚類中毒；此外非離子氨能降低魚類的能量代謝活動，損害其鰓、肝、腎、脾和甲狀腺組織，使其出現呼吸困難，分泌物增多，甚至衰竭死亡等一系列生理毒性反應［5，10］。亞硝酸氮是硝化作用與反硝化作用的一種中間產物，能將血紅蛋白中的二價鐵氧化成三價鐵，使血紅蛋白（Hb）轉變成不能攜氧的高鐵血紅蛋白（MHb），低濃度的亞硝酸氮可降低水生動物的抗病能力［11］，高濃度的亞硝酸氮可抑制血液的載氧能力，嚴重時會導致魚類缺氧而窒息死亡［12］，王明學等證實白鰱魚種血液中的高鐵血紅蛋白含量隨NO2-N濃度的升高而增多［13-14］，此外水生生物的非特異性免疫相關酶對低濃度的銨氮和亞硝酸氮表現出一定的應激反應［15］，抗氧化能力也會受到影響［16-18］。本試驗仔魚死亡前出現身體彎曲、體色變白、呼吸困難等癥狀，與上述致毒機理是相吻合的。

3.2 氨氮和亞硝酸氮的毒性比較

本試驗非離子氨和亞硝酸氮對裸項櫛蝦虎魚仔魚96 h LC50分別為9.1 mg/L和12.405 g/L，明顯高于一些魚類，如非離子氨對真鯛仔魚96 h LC50為0.28 mg/L［19］、對大菱鲆96 h LC50為1.14 mg/L（溶氧正常）與1.73 mg/L［20］（溶氧過飽和）；亞硝酸氮對真鯛仔魚（全長6±1 mm）96 h LC50為23.74 mg/L［19］、對大菱鲆的96 h LC50分別為0.13066 g/L（溶氧正常）和0.39078 g/L［23］（溶氧過飽和），其原因除與不同魚類的品種、體質、生長階段以及試驗環境的溫度、鹽度、pH、堿度、溶解氧等因素有關外，還可能與裸項櫛蝦虎魚為底棲魚類，對環境脅迫因子具有較強耐受能力有關。非離子氨和亞硝酸氮對裸項櫛蝦虎魚的毒性較低，表明裸項櫛蝦虎魚作為魚類實驗動物，具有便于實驗室飼養與推廣的優勢。

此外，本試驗非離子氨對裸項櫛蝦虎魚仔魚的毒性強于亞硝酸氮，這和其它文獻報道的結果一致［14、19、21-23］。

3.3 仔魚對銨態氮和亞硝酸氮的毒性反應

仔魚暴露于高濃度非離子態氨和亞硝酸氮中后先后出現呆滯、側游、呼吸困難、身體彎曲、體色變白等中毒癥狀，但非離子氨和亞硝酸氮引起仔魚的反應不同，非離子氨組仔魚死亡時魚體大多從中間向腹側彎曲，仔魚從出現畸形到死亡的過程發展得很快，而亞硝酸氮各濃度組中的仔魚死亡體色漸漸變白，仔魚從體色開始變化到死亡的過程，發展較慢，這種情況與鱖魚苗對銨態氮和亞硝酸氮的毒性反應基本相似，鱖魚苗接觸高濃度銨態氮和亞硝酸氮后，也出現昏迷、沉落水底，身體彎曲，體色變淡等中毒癥狀，且同樣亞硝酸氮組從體色變淺到死亡的時間較長［14］，大菱鲆對非離子氨和亞硝酸氮也有類似反應［20］。上述情況表明非離子氨和亞硝酸氮除共同影響魚類血液載氧能力外，其致毒機制存在差異，具體機制差異有待進一步研究。

3.4 非離子氨和亞硝酸氮的毒性影響因素

非離子氨（NH3）和亞硝酸氮的毒性取決于水中pH、水溫、鹽度、溶解氧等，pH值增高時，NH3的比率增大，pH小于7時，幾乎都以NH+4形式存在，pH大于ll時幾乎都以NH3形式存在，較高pH值條件下亞硝酸氮的毒性較弱；水溫升高時NH3的比率增大，毒性增強；鹽度升高時NH3的比率下降，養殖環境中亞硝酸氮的毒性降低；增加溶氧可以影響進入血液的NO2-N數量，提高血液的載氧能力和魚體對NH3的代謝能力，從而降低了亞硝酸氮和NH3的對魚體的毒性效應［10、20-21、24］；在 NaNO2溶液中加入CaC12和NaC1，24 h后魚類死亡率均明顯低于對照組，且 CaC12對 NO2-N的解毒作用好于 NaC1［25］，Horst等認為cl-/NO-2的比值可以抑制亞硝酸氮通過鰓浸入血液中，因而會降低亞硝酸氮的“表面毒性”［26］，Tomasso等曾經報道斑點叉尾鲴及硬頭鱒對亞硝酸氮的毒性受 Ca2+濃度的影響很大［27］，王明學等也認為CaC12對亞硝酸氮誘導草魚魚種血液產生高鐵血紅蛋白的抑制作用明顯高于 NaC1［28］，因此魚類養殖過程中應注意上述因素的改善。

參考文獻：

如作家路德維格·菲爾斯（Ludwig Fels）所說，威特金的照片，是“對一種源自古典時期的深刻精神性的見證”。威特金的藝術展現的是人生中那些基本的分類：愛與痛苦，快樂與折磨，愛神與死神。他是我們這個時代的攝影師中的哲學家。

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