建立H5N1流感病毒感染雪貂動物模型

鮑琳琳，占玲俊，鄧 巍，許黎黎，朱 華，呂 琦，李楓棣，秦 川

（中國醫學科學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

H5N1病毒從鳥直接傳到人的首次病例是於1997年在香港發現。迄今，絕大多數的人類感染病例都直接來自鳥，只有個別的病例被認為是來自被感染的人，不過H5N1病毒尚未能在人與人之間建立持續的傳播鏈。根據禽流感致病性的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感。由H5N1血清型引起的禽流感稱高致病性禽流感，發病率和死亡率都很高，危害巨大。高致病性禽流感病毒可以直接感染人類。1997年，在我國的香港地區，高致病性禽流感病毒H5N1型導致了18人感染，6人死亡，首次證實高致病性禽流感可以危及人的生命。

本研究選用人源 H5N1亞型禽流感病毒 A/ Vietnam/1203/2004對雪貂進行人工感染試驗，以期建立人源流感病毒感染雪貂模型［4-8］，為探索禽流感病毒的病原特性、致病機制、藥物篩選及其疫苗評價提供研究平臺。同時，為進一步防控禽流感在人間的暴發流行提供必要的實驗參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 H5N1病毒株：A/Vietnam/1203/2004（V），其HA效價都為1∶256，108TCID50/m L，由香港大學陳鴻霖教授惠贈。

1.1.2 動物：由美國引進去勢雪貂（Mustela Pulourius Furo）6只，4～10月齡，500～1200 g。實驗前進行血清學檢查，HI方法檢測 H1N1，H5N1抗體，抗體陰性為合格雪貂方可入組實驗。

1.1.3 試劑：RNA提取試劑盒 RNeasy Mini Kit購自QIAGEN公司，逆轉錄試劑盒SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis System購自Invitrogen公司，熒光染料Power SYBR Green PCR Master Mix，48孔0.2 mL PCR反應管 Fast Optical 48-well RXN Plate，及光學反應蓋膜48-Well Optical Adhesive Film 25PK均購自ABI公司，實時熒光定量 PCR儀為 ABI公司StepOne系列產品。

1.2 方法

1.2.1 雪貂的感染性

實驗在本所的BSL-2實驗室中進行。將6只雪貂隨機分為2個組，每個滴度3只，每籠一只。將雪貂采用獸用氯胺酮輕度麻醉，將流感 A/Vietnam/ 1203/2004病毒株分別以103TCID50和104TCID50滴鼻感染，每只雪貂鼻孔內均勻滴入500 uL病毒液。獨立送風隔離籠具中正常飼養。實驗的觀察期為5 d。

1.2.2 皮下芯片植入

實驗開始前2周，雪貂采用獸用氯胺酮輕度麻醉后，皮下植入芯片，通過芯片錄入實驗動物編號，每日讀取動物體溫數值。

1.2.3 臨床觀察和取樣

實驗開始前1周每日記錄雪貂體溫及體重變化作為感染前背景資料。感染后每天記錄體溫、體重變化、觀察并記錄有無咳嗽、流涕、嘔吐、腹瀉、氣促、呼吸困難、明顯食欲缺乏等臨床表現。感染前0 d，感染后第1～5天取鼻甲骨活檢物測定病毒載量和病毒滴度。感染后第5天安樂處死動物，取動物氣管、肺、心、肝、脾、腎、小腸、腦組織測定病毒病毒滴度，做病理檢查。

1.2.4 病毒滴度的測定

雪貂取肺組織、腸組織放入1 m L DMEM（青霉素、鏈霉素各1000 IU/m L）液中，用勻漿器將組織研磨成乳劑，3000 r/min離心10 min，取上清。組織上清液10×連續稀釋至10-8，接種于單層培養MDCK細胞的96孔細胞培養板上，每個稀釋度接種4個重復孔，CO2培養箱中35℃靜止培養，觀察記錄各孔細胞病變（CPE）情況，連續觀察3 d，用1％火雞血球復檢，出現凝集反應的結果為陽性。按照 Reed-Muench方法計算感染雪貂臟器病毒的TCID50。

1.2.5 病理學檢查

大體觀察，處死動物后，詳細觀察氣管、肺、心、肝、脾、腎、小腸、腦組織的形態變化；病理切片制備，取處死動物的肺等組織，10％甲醛固定，石蠟包埋，常規病理組織切片處理后，HE方法染色，鏡檢觀察。

1.2.6 PCR檢測

鼻甲骨活檢物可以直接應用試劑盒RNeasy kit （Qiagen）提取 RNA。鼻甲骨活檢物溶于 1 m L DMEM培養基中，RNA最終濃度溶入無RNA酶的水中。總RNA中取8μL RNA應用SuperScriptⅢReverse Transcriptase（Invitrogen）逆 轉 錄。取cDNA2μL應用Power SYBR Green PCR Master Mix （ABI）作 定 量PCR。引 物：NP688Fwd5’-ttccaaacagcagcacaaag-3’ ， NP817Rvs25’-tatgggc caatgatcctctc-3’。程序：①94℃ for 3 m in；②94℃ for 30 s，③61℃ for 30 s，④72℃ for 30 s（②-④運行35個循環），⑤95℃，15 s；⑥60℃，1 m in；此后運行溶解曲線程序，95℃，15 s，60℃，1 min；95℃，15 s。熒光定量PCR儀可直接讀取病毒載量結果。

2 結果

2.1 雪貂感染后體重變化

雪貂感染后出現體重下降，103TCID50組和104TCID50組由感染后第1天一直持續到實驗結束，104TCID50組在感染后體重下降最高達20％以上，體重變化見表1。雪貂感染后體重變化率見圖1。

圖1 雪貂感染后體重變化率（％）Fig.1 Body weight change of ferrets（％）體重變化率％=（當天體重-0天體重）/0天體重*100％Weight change rate％=（the day weight-0 day weight）/0 day weight*100％

2.2 雪貂感染后體溫變化

雪貂感染后出現體溫升高，與感染前比較體溫最高上升2℃。103TCID50和104TCID50組雪貂在感染后第2天出現體溫升高，一直持續到實驗結束（感染后第5天），體溫變化見圖2。

圖2 雪貂感染后體溫變化（℃） Fig.2 Body temperature change（℃）

2.3 雪貂感染后臨床表現

雪貂感染然后表現為

臨床評分標準：NIH提供的雪貂感染實驗觀察指標分為鼻部癥狀和活動度兩個部分，具體指標見表1。

表1 雪貂感染后臨床評分標準Tab.1 Criteria for clinical sign score

雪貂感染后出現以活動度下降為主臨床改變，即表現為不活躍、對外界刺激的反應性下降，上呼吸道感染的癥狀如：打噴嚏、流鼻涕、呼吸困難的癥狀幾乎觀察不到。具體到2個劑量組的反應可以看到104TCID50組癥狀要明顯較103TCID50組嚴重，也主要是以活動度下降為表現的改變。其中103TCID50組雪貂感染后第4天2#死亡，104TCID50組雪貂感染后第5天6#死亡，特別值得注意的是感染雪貂死亡前臨床沒有出現突然地體溫升高、呼吸急促、呼吸困難等癥狀。雪貂感染后臨床變化情況見圖3。

圖3 雪貂感染后臨床表現評分Fig.3 Score of clinical sign

2.4 感染雪貂病理變化結果

雪貂感染H5N1病毒第5天后肺組織大體呈現多個肺葉腹側面和背側面出現片狀灶狀的壞死灶和出血灶，其他組織大體觀察未發現明顯異常。鏡下觀察發現肺組織呈炎性充血、出血、水腫、壞死、滲出的重度肺炎病理改變。大腦組織可見局灶性腦炎，血管周圍炎細胞呈“套袖”裝浸潤，可見小灶狀壞死。免疫組化染色可以觀察到，盡管小腸組織沒有觀察到病變，在肺組織、腦組織、小腸組織均可以看到被病毒感染的陽性細胞，見彩插5圖4。

表2 雪貂感染后鼻甲骨活檢物病毒培養滴度情況（單位：log10 TCID50） Tab.2 Virus detection and titration in samples from nasal cavity（log10 TCID50）

表3 雪貂感染后組織病毒培養滴度情況（單位：log10 TCID50）Tab.3 Virus culture from tissues of ferrets（log10 TCID50）

2.5 感染雪貂病毒的復制及釋放

雪貂感染后，每天取鼻甲骨活檢物做病毒滴度測定，結果顯示103TCID50組雪貂在感染后第2～3天檢測到病毒，病毒滴度為102.3～103.8TCID50。104TCID50組雪貂在感染后第1～5天都檢測到病毒，病毒滴度為 102.3～103.8TCID50。病毒分離結果顯示雪貂在感染后上呼吸道排毒是呈現隨感染的天數逐漸上升的趨勢，即表示病毒在上呼吸道不斷復制排出。這與溫和的季流病毒比較有明顯的不同，H3N2病毒株感染后通常會出現上呼吸道的病毒排出隨天數增加而下降，H5N1作為高致病流感病毒株致死率高可能與這個結果有一定的關系。鼻甲骨活檢物病毒滴度結果見表2。

雪貂在感染后第5天安樂處死，取雪貂氣管、肺、心、肝、脾、腎、小腸、腦組織做病毒滴度測定。結果顯示各個組織都能夠分離到病毒，其中以氣管和肺組織的病毒滴度最高，103TCID50組雪貂病毒分離的陽性率為5/24，104TCID50組雪貂病毒分離的陽性率為13/24。以上的結果反映了H5N1病毒感染雪貂，呼吸系統的器官是病毒侵襲的重要對象，呼吸系統以外的器官也會受到病毒的攻擊，并且病毒可以突破血腦屏障感染腦組織，這就解釋了為什么感染禽流感病毒病人會出現多系統多器官受損和出現神經系統的癥狀。各組織臟器病毒滴度結果見表3。

雪貂感染后，每天取鼻甲骨活檢物做病毒載量測定，結果顯示103TCID50組和104TCID50組雪貂在感染后第1天至感染后第5天，病毒載量呈現曲線上升的趨勢，這與病毒分離的結果是相一致的，結果見圖5。

3 討論

圖5 雪貂鼻中病毒載量變化Fig.5 Virus loading on nose of ferrets infected

H5N1型高致病情流感傳播途徑主要有兩種，通過水禽或其污染物直接傳到人或通過中間宿主（如：豬）傳到人。人感染高致病性禽流感后，起病很急，早期表現類似普通型流感。主要表現為發熱，體溫大多在39℃以上，持續1～7 d，一般為3～4 d，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、頭痛、全身不適，部分患者可有惡心、腹痛、腹瀉、稀水樣便等消化道癥狀，極少數會出現神經系統癥狀。高致病禽流感感染死亡率超過60％。

實驗結果顯示，A/Vietnam/1203/2004人源H5N1型禽流感病毒可以感染雪貂，應用的病毒滴度死亡率為33％。感染后在雪貂除氣管和肺組織還可在心、肝、脾、腎、小腸、腦組織中分離到病毒。說明該病毒能夠侵染雪貂的肺、腦、肝、腎等多種器官并造成神經系統感染，這與感染人的H5N1禽流感病毒毒株具有共同的特性［9-10］。雪貂鼻甲骨活檢物病毒分離結果顯示病毒在感染后第2天至第5天呈現上升的趨勢，病毒載量的結果與此結果相一致，這與溫和型的季節性流感H3N2在雪貂上的表現不一致（病毒釋放呈逐天下降的趨勢）［2］。這可能也是雪貂感染后持續體溫升高，體重嚴重下降，活動度下降的原因之一。雪貂的臨床癥狀出現的早晚和嚴重程度與接毒量有關，接毒量大的雪貂體重下降快，癥狀出現早，體重下降多；隨接毒量減少癥狀出現漸晚，癥狀減輕。因此，有理由推斷，即使H5N1型禽流感在人間大流行，因個體差異和接觸病毒量的差別，其致病性也會有所差異。感染后雪貂解剖發現肺組織呈炎性充血、出血、水腫、壞死、滲出的重度肺炎病理改變，腦組織的組化染色中可以觀察到被病毒感染的陽性細胞。

雪貂對該H5N1型禽流感病毒呈現出規律的與人類感染流感病毒相似的以肺炎為主的臨床癥狀、典型的病理變化和高致死率，是良好的H5N1相關研究的動物模型。

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