采用動態熱回流法制備蓮花菌多糖

趙永亮，侯啟昌，李磊，郭家瑞，崔羽佳，李鵬，王衛國

（1. 河南工業大學 生物工程學院，河南 鄭州，450001；2. 河南廣播電視大學，河南 鄭州，450003）

采用動態熱回流法制備蓮花菌多糖

趙永亮1，侯啟昌2，李磊1，郭家瑞1，崔羽佳1，李鵬1，王衛國1

（1. 河南工業大學 生物工程學院，河南 鄭州，450001；2. 河南廣播電視大學，河南 鄭州，450003）

以蓮花菌子實體為材料，采用動態熱回流法制備蓮花菌多糖。通過單因素試驗和正交試驗研究原料顆粒粒徑、提取溫度、溶液pH、液料比、溶劑回流率、提取時間對蓮花菌多糖提取效果的影響，并將動態熱回流法與傳統熱水浸提法進行比較。研究結果表明：動態熱回流法制備蓮花菌多糖的最佳工藝條件是：原料顆粒粉碎度為3 500 μm，提取溫度為95 ℃，溶液pH為6.5，液料比為6.5?1.0，溶劑回流率為15%，提取時間為90 min，在此條件下，粗多糖得率可以達到13.98%，比傳統熱水浸提法提高16.1%，提取時間比傳統法減少了3/4，溶劑用量比傳統法減少了7/8。該方法可用于蓮花菌多糖的規模化制備生產，亦可為其他真菌多糖及相關產品的大規模工業生產提供借鑒。

蓮花菌（灰樹花）；多糖；動態熱回流法

蓮花菌（Maitake）又名灰樹花（Grifola frondosa），是一種珍貴的食、藥兩用真菌，營養豐富，含有大量的生物活性物質。蓮花菌的提取物蓮花菌多糖具有明顯的抗HIV（艾滋病病毒），抗腫瘤，改善免疫系統功能，調節血糖、血脂及膽固醇水平，降血壓等作用[1?6]。特別是其抗腫瘤活性，Nanba等用灰樹花多糖進行抗腫瘤實驗，結果表明，灰樹花多糖的抑瘤率達86.5%，比國際公認的抗癌生物免疫調節劑香菇多糖抑制率高32%[7]。隨著人們對蓮花菌多糖的理化性質、生理藥理功能等研究的深入，蓮花菌多糖廣闊的開發應用前景已引起了人們的關注，關于蓮花菌多糖提取方法的報道也不斷出現。這些方法可以分為傳統方法和新型方法2類。傳統方法如熱水浸提法，酸、堿浸提法等由于存在能源利用率低、溶劑用量大、損失多、生產周期長、生產難以滿足生產和研究的需要。研究較多的新型方法有超聲波輔助浸提法、酶法、微波輔助浸提法[8?10]等。與傳統提取法相比，這些新方法都有提取率較高，節省時間，節約溶劑等特點[11?13]。但超聲波法對儀器和容器的要求太高，目前只在實驗室小規模研究使用；微波法的研究尚屬起步，其工藝上有一些尚未解決的問題，如密閉式萃取時高溫高壓會破壞物質結構，開放式萃取時萃取不均勻等，因此，目前應用于工業生產的微波提取設備甚少；由于酶的生物特性，酶法提取中對溫度及pH等反應條件的要求很嚴格，因此，對實驗設備的要求較高，且酶法提取過程中，有可能改變原料中某些成分，產生新的化學物質[14?17]。而且這3種新型方法均不能實現浸煮和濃縮的連續化操作，都不利于工業化大規模生產。鑒于此，本文作者以蓮花菌子實體干品為材料，探討了一種提取蓮花菌多糖的新方法?溶媒多級循環動態熱回流提取法制備蓮花菌多糖的效果，并與傳統熱水提取法進行了比較，旨在為蓮花菌多糖的工業化生產提供一定的借鑒。

1 材料及方法

1.1 實驗材料及儀器

實驗材料為：蓮花菌子實體（Grifola frondosa），為市售干品。試驗所用苯酚、硫酸、氫氧化鈉、葡萄糖、乙醇等，均為分析純。

實驗儀器有：DHG?9140A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司制造）；FA1204B電子天平（上海精密科學儀器有限公司制造）；SJN Ⅱ?100熱回流提取濃縮機組（天津隆業輕工機械有限公司制造）；723N可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司制造）；HH?4數顯恒溫水浴鍋（河南智誠科技發展有限公司制造）；YSW?40B萬能粉碎機（北京燕山正德機械設備有限公司制造）。

1.2 試驗方法

1.2.1 動態熱回流法制備蓮花菌多糖方案及工藝流程

制備蓮花菌多糖的方案及工藝流程如圖1所示。其基本過程及特點如下：把洗凈、干燥并粉碎成適當大小的蓮花菌子實體放入提取罐內，加入適量的水做溶媒，采用蒸汽加熱，使溶媒在藥材間循環流動；提取一定的時間后把提取液經過濾器過濾，直接送入雙效濃縮器，濃縮罐Ⅰ產生的一次蒸汽可讓濃縮罐Ⅱ利用（作為濃縮罐Ⅱ的熱源），亦可冷凝后與濃縮罐Ⅱ的二次蒸汽冷凝成的熱液體一起回流到常壓的提取罐，作為新溶劑和熱源，這樣邊提取邊濃縮，直到得到符合工藝要求的濃縮中間體；冷卻后將其泵入醇沉罐，用乙醇進行醇沉。最后過濾干燥，得到成品。

圖1 動態熱回流法制備蓮花菌多糖工藝流程圖Fig.1 Flow chart of preparation of polysaccharides from grifola frondosa using method of dynamic hot reflux

1.2.2 單因素試驗

選定6個可能影響多糖提取的因素，包括原料顆粒粉碎度、提取溫度、溶液pH、液料比、溶劑回流率和提取時間。針對這6個因素，分別在保持其他因素不變的條件下進行單因素試驗，每個水平試驗重復3次，取其平均值，考察各因素對灰樹花粗多糖得率、粗多糖含糖量及凈多糖得率的影響，對結果做顯著性分析。

將原料粉碎的顆粒粒徑分為0.06，1.00，3.00，5.00和7.00 mm 5個等級，分別進行提取試驗，以確定最佳的顆粒粉碎度。

在溫度為60，85，90，95和100 ℃時分別進行提取，觀察試驗結果，以確定最佳提取溫度。

分別在溶劑pH為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0下進行提取，以確定最佳提取pH。

在液料比分別為4?1，5?1，6?1，7?1，8?1時進行提取，以確定最佳液料比。

在回流率分別為5%，10%，15%，20%，25%時進行提取，以確定最佳回流率。

提取時間分別為30，60，90，120和150 min時進行提取，以確定最佳提取時間。

1.2.3 正交試驗

為了進一步優化蓮花菌多糖的提取條件，根據單因素試驗的結果，選取顯著性分析為極顯著的4個因素即顆粒粉碎度、提取溫度、溶液pH、液料比為考察因素，以灰樹花粗多糖得率作為考核指標，每個因素擬定4個水平，采用L16（45）正交表在溶劑回流率為15%，提取時間為90 min條件下進行正交試驗，每個試驗重復3次，取其平均值。正交試驗因素水平如表1所示。

表1 動態熱回流法制備蓮花菌多糖正交試驗因素水平表Table 1 Factor level of preparation of polysaccharides from grifola frondosa

1.2.4 水分含量測定

采用干燥恒重法測定水分含量[18]。稱取蓮花菌子實體干品2 g于105 ℃下恒溫干燥至恒重，測定其水分。試驗重復3次，取其平均值。

1.2.5 蓮花菌多糖含量測定

用苯酚?硫酸法測定多糖含量[19]。

（1） 制作標準曲線：將40 mg/L標準葡萄糖溶液，6%苯酚和濃硫酸按照表2所示比例加入到試管中，靜置10 min，搖勻，于室溫下反應20 min后于波長490 nm下測吸光度，以2.0 mL水做空白樣，以糖含量為橫坐標，吸光度為縱坐標做出標準曲線，得到標準曲線回歸方程為：y= 0.008 7x?0.005 9，R=0.999 5。

（2） 樣品中多糖含量測定：準確稱取干燥后的粗多糖150 mg于500 mL容量瓶中定容。吸取1 mL溶液測吸光度，通過標準曲線讀出多糖含量。

1.2.6 傳統熱水浸提法制備蓮花菌多糖

稱取粉碎后（60 μm）的子實體干品100 g，加3 kg水，調pH至6.5，于98 ℃浸提3 h。在浸提過程中，保持浸提液體積恒定，重復提取2次，過濾后合并濾液，濃縮，用乙醇進行醇沉，干燥，測粗多糖得率[20?21]。

1.2.7 數據處理方法

單因素試驗結果取3次重復試驗的平均值，考察粗多糖得率、多糖含量和凈多糖得率3個指標。

表2 苯酚?硫酸法試劑的配制Table 2 Preparation of phenol-sulfuric acid reagent

其中：F0為粗多糖得率；m為粗多糖質量；M為原料質量；x為含水量。

凈多糖得率為：

其中：d為多糖含量。采用方差分析法對單因素試驗及正交試驗結果進行統計學分析，用F檢驗判斷組間差異有無顯著性。

2 結果與分析

2.1 水分含量

干燥恒重法測得蓮花菌子實體的含水量為10.12%。

2.2 動態熱回流法制備蓮花菌多糖單因素試驗結果分析

2.2.1 不同原料粉碎顆粒度對蓮花菌多糖提取效果的影響

在提取溫度為95 ℃，溶液pH為7.0，液料比為7?1，溶劑回流率為15%，提取時間為90 min的試驗條件下，不同的原料顆粒粒徑對粗多糖得率、含糖量及凈多糖得率的影響如圖2所示。由圖2可以看出：當顆粒粒徑從0.06 mm升高到1.00 mm時，粗多糖得率從10.90%降低到8.77%，但含糖量從12.45%升高到了13.98%。這是因為顆粒粒徑的不同，導致原料與溶劑的接觸面積不同，對提取速度和多糖得率產生影響，顆粒粒徑小，多糖溶出較快，但溶出的多糖所含雜質較多；當顆粒粒徑為3.00 mm時，粗多糖得率達到最大的12.24%，含糖量為15.67%，凈多糖得率1.91%，均達到最大值；顆粒粒徑大于3.00 mm時，粗多糖得率、含糖量及凈多糖得率均大幅度下降；當顆粒粒徑為7.00 mm時，粗多糖得率僅為9.23%，凈多糖得率也只有1.30%。因此，本試驗認為顆粒粒徑為3.00 mm時的效果最好。F檢驗結果表明：粗多糖得率F＞F0.01，顯著性p＜0.01，原料顆粒粒徑對粗多糖得率的影響是極顯著的。

圖2 顆粒度對蓮花菌多糖提取效果的影響Fig.2 Effect of raw material particle size on extraction of polysaccharides from grifola frondosa

2.2.2 不同提取溫度對蓮花菌多糖提取效果的影響

圖3 提取溫度對蓮花菌多糖提取效果的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction of polysaccharides from grifola frondosa

在原料顆粒粒徑為3.0 mm，溶液pH為7.0，液料比為7?1，溶劑回流率為15%，提取時間為90 min的試驗條件下，不同的提取溫度對粗多糖得率、含糖量及凈多糖得率的影響如圖3所示。由圖3可以看出：60 ℃時，粗多糖得率僅為6.53%，95 ℃時達到了12.73%，凈多糖得率也從1.21%升高到2.00%。高溫能夠提高產量是因為隨著提取溫度的升高，細胞壁的滲透能力和多糖的溶解度逐漸升高，促進了多糖的溶出。但當溫度為100 ℃時，粗多糖的得率和凈多糖得率均有所下降，可能的原因是過高的溫度會破壞多糖的結構，使多糖含量減少。綜合各方面因素考慮，本研究認為提取溫度為95 ℃較為合適。F檢驗結果表明，粗多糖得率F＞F0.01，p＜0.01，溫度對蓮花菌多糖制備得率的影響達到了極顯著水平。

2.2.3 不同溶液pH對蓮花菌多糖提取效果的影響

在原料顆粒粒徑為3.00 mm，提取溫度為95 ℃，液料比為7?1，溶劑回流率為15%，提取時間為90 min的試驗條件下，pH對粗多糖得率、粗多糖的含糖量及凈多糖得率均有較大影響。由圖4可以看出：當pH小于7.0時，隨著pH的升高，粗多糖得率和含糖量都升高；pH為7.0時的粗多糖得率為12.80%，是pH為4.0時粗多糖得率的2倍多；凈多糖得率也從0.81%升高到1.95%；當pH從6.0升到7.0時，粗多糖含量、含糖量及凈多糖得率只是略有增加；當pH為8.0時粗糖得率急劇下降到8.11%，由此可以推斷：蓮花菌多糖是一種弱酸或中性物質，其最佳提取pH范圍為6.0～7.0。為了使工序更為簡單（不用調節溶劑pH），以及從成本方面考慮，本試驗選擇最適pH為7.0。F檢驗表明，粗多糖得率F＞F0.01，p＜0.01，pH對粗多糖得率的影響達到了極顯著水平。

圖4 pH對蓮花菌多糖提取效果的影響Fig.4 Effect of pH on extraction of polysaccharides from grifola frondosa

2.2.4 不同液料比對蓮花菌多糖提取效果的影響

在原料顆粒粒徑為3.00 mm，提取溫度為95 ℃，溶液pH為7.0，溶劑回流率為15%，提取時間為90 min的試驗條件下，液料比對多糖提取效果的影響如圖5所示。從圖5可見：當液料比小于6?1時，隨著液料比的升高，粗多糖得率、含糖量、凈多糖得率均增加；當料液比為4?1時，粗多糖得率僅為6.41%，當液料比為6?1時，粗多糖得率達到最大的12.89%；當液料比為7?1時，雖然粗多糖得率為12.69%，比6?1時的略低，但含糖量為15.33%，凈多糖得率為1.95%，均比液料比為6?1時的高。當液料比高于7?1后，粗多糖得率、含糖量、凈多糖得率均沒有明顯變化；所以，綜合考慮粗多糖得率，含糖量及凈多糖得率，本實驗認為液料比為7?1時最為適宜。F檢驗表明：粗多糖得率F＞F0.01，p＜0.01，液料比對粗多糖得率的影響達到了極顯著水平。

圖5 液料比對蓮花菌多糖提取效果的影響Fig.5 Effect of mass ratio of water to material on extraction of polysaccharides from grifola frondosa

2.2.5 不同溶劑回流率對蓮花菌多糖提取效果的影響

在原料粉碎顆粒粒徑為3.00 mm，提取溫度為95℃，溶液pH為7.0，液料比為7?1，提取時間為90 min時，不同溶劑回流率對提取效果的影響如圖6所示。從圖6可見：粗多糖得率及含糖量在回流率從5%到15%呈現增長趨勢；當回流率為15%時，粗多糖得率為12.85%，含糖量也達到了15.48%。但F分析可以看出，粗多糖得率F＜F0.05，p＞0.05，溶劑回流率對粗多糖得率的影響并不顯著。這是因為雖然動態熱回流法能使藥材與溶劑的濃度差（梯度）越來越大，從而使多糖溶出速度加快，但并不能對多糖得率產生明顯影響（差異不顯著）。當回流率超過20%時，多糖得率反而略有降低。原因是回流率過大，易造成濃縮罐內溶液蒸發過快，使多糖粘附在罐的內壁。因此，本試驗選擇15%為最適溶劑回流率。

圖6 溶劑回流率對蓮花菌多糖提取效果的影響Fig.6 Effect of reflux rate of solvent on extraction of polysaccharides from grifola frondosa

2.2.6 不同提取時間對蓮花菌多糖提取效果的影響

在原料粉碎顆粒粒徑為3.00 mm，提取溫度為95℃，溶液pH為7.0，液料比為7?1，溶劑回流率為15%時不同提取時間對蓮花菌多糖提取效果的影響如圖7所示。從圖7可以看出：隨著提取時間的延長，粗多糖得率、含糖量和凈多糖得率均增加；當提取時間為30 min時，粗多糖得率為9.68%，提取時間為90 min時，粗多糖得率達到12.76%，比30 min時增加了31.82%，可見，適當延長提取時間可以有效提高提取效果。但提取時間超過90 min后，粗多糖得率、含糖量、凈多糖得率均無明顯的升高，甚至當提取時間為150 min時，含糖量為15.09%，較90 min時的含糖量15.15%有所降低。這是因為可溶物質與溶劑的濃度梯度已經接近最大值，繼續增加提取時間已很難使多糖析出，還可能是長時間高溫使多糖結構受到破壞。因此，本試驗選擇90 min為最佳提取時間。F檢驗結果表明：粗多糖得率F＞F0.05，p＜0.05，提取時間對蓮花菌多糖制備得率的影響達到了顯著水平。

圖7 提取時間對蓮花菌多糖提取效果的影響Fig.7 Effect of time on extraction of polysaccharides from grifola frondosa

2.3 正交試驗結果分析

正交試驗結果的極差分析結果見表3。從表3可以看出：顆粒粒徑、提取溫度、液料比、pH對多糖提取效果影響不同，其影響程度從大到小依次為：pH，提取溫度，顆粒粒徑和液料比。試驗的最佳組合應為A4B3C2D2，即顆粒粒徑為3.50 mm，提取溫度為95 ℃，液料比為6.5?1.0，溶劑pH為6.5。從正交試驗方差分析（表4）可以看出，pH和提取溫度的影響達到了極顯著水平，而顆粒粒徑和料液比的影響均不顯著。

表3 動態熱回流法制備蓮花菌多糖正交試驗及極差分析結果Table 3 Orthogonal test and range analysis results of extraction of polysaccharides from grifola frondosa using dynamic hot reflux method

表4 動態熱回流法制備蓮花菌多糖正交試驗方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test for extraction of polysaccharides from grifola frondosa using dynamic hot reflux method

綜合單因素和正交試驗結果，得出動態熱回流法制備蓮花菌多糖的最佳工藝條件如下：原料顆粒粒徑為3.50 mm，提取溫度為95 ℃，pH為6.5，液料比為6.5?1.0，溶劑回流率為15%，提取時間為90 min。

按照最佳提取條件做驗證試驗3次，蓮花菌粗多糖得率分別為13.84%，13.98%和14.12%，平均值為13.98%。

2.4 熱回流法與傳統熱水浸提法制備蓮花菌多糖的效果比較

采用傳統熱水浸提法提取多糖3次，粗多糖得率分別為12.16%，11.65%和12.31%，平均值為12.04%。采用動態熱回流法與傳統熱水浸提法的比較結果如表5所示。從表5可見：動態熱回流法得到的多糖得率為13.98%，相對于傳統熱水提取法的得到的多糖得率12.04%，增幅達到16.1%。并且動態熱回流法的提取時間比傳統熱水浸提法的提取時間減少3/4，提取液用量僅為傳統熱水浸提法的1/8，顆粒粒徑遠遠比由傳統方法所得的顆粒粒徑大。

表5 動態熱回流法與傳統熱水浸提法制備蓮花菌多糖的效果比較Table 5 Comparison of extraction of polysaccharides from grifola frondosa using dynamic hot reflux and traditional hot water distilling

3 討論

動態熱回流法的整個提取過程在一個密閉系統內進行，不會產生跑、冒、滴、漏現象，并且還能把提取濃縮過程中所產生的大量的一次/二次蒸汽經冷凝成熱液體返回到提取罐內作為提取罐新的溶劑。一級濃縮罐中的蒸汽還可不冷凝直接作為二級濃縮罐新的熱源，這樣既可節省能源又能使藥材與溶劑的濃度差（梯度）越來越大，大大加快有效成分的浸出速度，縮短提取時間。傳統提取方法要求藥材原料粉碎的顆粒粒徑很小（＜250 μm），以增大提取溶劑的接觸面積，增加藥物的浸出，但是，藥材粉碎的粒徑越小，就越不利于后續的離心、分離等操作。而動態熱回流法不需要將藥材粉碎的很小，靠不斷回流溶劑增加濃度差，就保證了提取率，還有利于后續的離心和分離操作。

對于多糖制備效果多采用粗多糖得率作為考察指標，由于不同條件下制備的粗多糖的雜質含量不一致，僅用粗多糖得率表示提取效果顯然不完善。本研究采用粗多糖得率、多糖含量和凈多糖量3個指標，這樣可以更充分、更科學地表示不同因素水平對蓮花菌多糖制備效果的影響。

動態熱回流提取法不需要非常貴重的設備，并且高效，節能，經濟效益巨大。1個年產600 t蓮花菌粗多糖（10%～15%）的工廠，若采用動態熱回流工藝代替傳統工藝，則每年可節約水24萬多t，節約電480多萬kW·h，約折合人民幣374萬元。按蓮花菌粗多糖500元/kg計，每年可凈賺2 300萬元（成本按鄭州市工業用電0.671元/（kW·h），工業用水2.28元/m3，灰樹花60元/kg計算）。

4 結論

（1） 動態熱回流法提取蓮花菌多糖的最佳工藝條件如下：原料顆粒粒徑3.50 mm，提取溫度為95 ℃，pH為6.5，液料比為6.5?1.0，溶劑回流率為15%，提取時間為90 min。與傳統熱水浸提法相比，動態熱回流法的粗多糖得率提高了16.1%，提取時間縮短了3/4，溶劑用量減少了7/8。

（2） 動態熱回流法不僅經濟效益顯著，而且節能環保，具有重要的現實意義。該方法可用于蓮花菌多糖的規模化制備生產，亦可為其他真菌多糖及相關產品的大規模工業生產提供借鑒。

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（編輯 趙俊）

Preparation of polysaccharides from Grifola frondosa using dynamic hot reflux extraction

ZHAO Yong-liang1, HOU Qi-chang2, LI Lei1, GUO Jia-rui1, CUI Yu-jia1, LI Peng1, WANG Wei-guo1

（1. School of Bioengineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China; 2. Henan Broadcast University, Zhengzhou 450003, China）

A novel method of dynamic hot reflux extraction for the preparation of polysaccharides from the fruitbody ofGrifola frondosawas researched. The factors that affect the extraction of maitake polysaccharides including size of raw material particles, extraction temperature, pH, mass ratios of water to material, reflux rate of solvent and extraction time were studied by single factor test and orthogonal test. The extraction effect of dynamic hot reflux method was compared with that of traditional hot water distilling extraction. The results show that the optimal conditions of extraction with dynamic hot reflux technology are as follows： The size of raw material particles is 3 500 μm in diameter, extraction temperature is 95 ℃, mass ratio of water to material is 6.5?1.0, pH=6.5, reflux rate of solvent is 15%, extraction time is 90 min. In the optimal conditions, the maitake polysaccharides extraction rate of dynamic hot reflux method reaches 13.98% and rises by 16.1% compared with traditional hot water distilling extraction. And this novel method can shorten 3/4 time of extraction and save 7/8 of the extraction solvent. The method not only makes large-scale industrial production of maitake polysaccharides, but also can be a reference for large-scale industrial production of other fungal polysaccharides.

maitake（Grifola frondosa）; polysaccharides; dynamic hot reflux

Q81；Q93；R9；R28

A

1672?7207（2011）01?0038?08

2010?04?10；

2010?07?23

河南工業大學引進人才專項（2007BS023）；河南省科技廳攻關計劃項目（0124060026，0124060011）

王衛國（1962?），男，河南汝州人，教授，從事微生物與生化藥學研究；電話：0371-67756513；Email： wwgwang@yahoo.com.cn