大黃素-BSA不同表位構型的免疫原性和特異性研究

李麗華 劉文泰 戴 軍 竇玉紅 王 茹 劉艷臣 彭 洋 （河北醫科大學,石家莊 050091）

大黃素-BSA不同表位構型的免疫原性和特異性研究

李麗華 劉文泰 戴 軍 竇玉紅 王 茹 劉艷臣 彭 洋 （河北醫科大學,石家莊 050091）

目的:研究不同偶聯法制備大黃素-BSA的大黃素表位構型及其免疫原性和特異性。方法:用重氮化對氨基苯甲酸偶聯法和琥珀酸酐偶聯法制備兩種不同表位構型的大黃素-BSA1和大黃素-BSA2抗原,免疫小鼠制備抗血清,用醋酸纖維素膜雙向免疫擴散法檢測免疫原性及其抗體特異性。結果:大黃素-BSA1和大黃素-BSA2抗血清與大黃素反應的抗體效價分別為1∶144 0±357.771和1∶440±219.089,二者有極顯著性差異（P=0.006）。分別與大黃素等五種蒽醌類化合物反應,前者對大黃素有較高特異性,抗原結合效價可達1∶1 843.2±457.947。后者對大黃素的特異性較低,結合效價僅為1∶8.8±4.382。結論:兩種偶聯法制備大黃素-BSA的表位構型不同,其免疫原性和特異性存在著顯著差異。重氮化對氨基苯甲酸偶聯法制備大黃素-BSA的免疫原性較高、大黃素特異性較強。

抗原抗體反應;雙向免疫擴散法;大黃素;半抗原-載體偶聯法;表位

制備抗中藥成分抗體,運用抗原抗體檢測技術定性或定量測定中藥成分,對于鑒定中藥材品質和控制中藥制劑質量,具有廣闊的應用前景。中藥的有效或標志性成分,多數是小分子半抗原,須與大分子載體偶聯成半抗原-載體復合物,才具免疫原性,方能制備抗體。在制備半抗原-載體復合物時,選擇中藥小分子成分（半抗原）與蛋白載體連接的偶聯方法,決定著半抗原的表位構型,直接影響著其免疫原性和特異性。

大黃素為蒽醌類化合物,是蓼科中藥材中常見的有效成分和標示性成分。蒽醌母核上6號位酚羥基,是大黃素區別于大黃素甲醚和大黃酚的特征性結構,因此,大黃素是研究半抗原-載體復合物表位構型及其特異性的理想實驗材料[1]。本文以大黃素酚羥基與載體連接的琥珀酸酐偶聯法和以酚羥基鄰位或對位與載體連接的重氮化對氨基苯甲酸偶聯法,制備了兩種不同表位構型的大黃素-牛血清蛋白（BSA）抗原,通過免疫小鼠制備抗血清,研究了兩種抗原的免疫原性和特異性[2,3]。并依據實驗結果和大黃素化學結構,探討分析了兩種抗原的大黃素表位構型與免疫原性和特異性關系。

1 材料與方法

1.1 藥品與器材 大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃酸標準品（DELTA天然有機化合物信息中心）;小牛血清白蛋白、EDCI（Sigma公司）;透析袋（上海華美生物工程有限公司）;醋酸纖維素膜（浙江四青生化材料廠）;紫外分光光度計（λ-2,1 100 nm,美國PE公司）;其他試劑均為分析純。

1.2 大黃素-BSA的偶聯方法

1.2.1 重氮化對氨基苯甲酸偶聯法[4]取對氨基苯甲酸800mg,亞硝酸鈉400mg溶于三蒸水10ml中,置冰浴中攪拌20分鐘,加少量尿素得重氮鹽溶液。取大黃素140mg溶于2%碳酸鈉溶液（pH9.0）10m l,在不斷攪拌下逐滴加入到重氮鹽溶液中,室溫攪拌25分鐘。然后逐滴加入BSA溶液（BSA 500 mg溶于pH7.4 0.01mol/L PBS 25m l溶液）和EDCI 91mg,避光攪拌20小時。最后將其置于透析袋中,4℃用PBS液透析兩天,期間多次換液,至透析袋外液幾乎無色為止,取透析袋內容物,用PBS液調至50m l,即為大黃素-BSA1,分裝后冷凍保存。

1.2.2 琥珀酸酐偶聯法[5]取琥珀酸酐80 mg溶于二氧六環10m l后,加入大黃素140 mg,攪拌溶解,再加入三乙胺0.25m l,置30℃攪拌1小時,待溶液冷卻至室溫后,同1.2.1法制得大黃素-BSA 2。

1.2.3 大黃素-BSA結合比的測定與計算[2]大黃素-BSA結合比,即每分子BSA所結合大黃素的分子數。用紫外分光光度計對大黃素、BSA、大黃素-BSA和末次透析外液,從波長200 nm到600 nm進行掃描,取 450 nm 處吸光度 ,依公式 N=（E半抗原-載體復合物-E載體）/E半抗原,計算大黃素-BSA 結合比。E=（A/CL）×M/10（L為測定時液層厚度,M為吸光物質的摩爾質量,A為所測吸光度,C為被測物濃度,C大黃素-BSA以CBSA為準）。第一次計算時,因尚不清楚每分子BSA所結合大黃素的分子數,故取BSA的M值作為大黃素-BSA的估算值,所得結合比需進行再次回歸計算,再次回歸計算時M大黃素-BSA=68000+270×N。

1.3 抗血清的制備

1.3.1 實驗動物及其分組 雌性昆明小鼠,6周齡,體重20克,清潔級,購于河北醫科大學實驗動物中心,合格證號903041,自行飼養。隨機分成大黃素-BSA1組、大黃素-BSA2組、實驗對照組,每組5只。

1.3.2 免疫小鼠制備抗血清 初次免疫取抗原0.3 ml與等量不完全弗氏佐劑混合乳化后,多點皮下注射0.1 ml/只。兩周后同上法加強免疫一次,免疫劑量為0.08ml/只。再間隔兩周,用不加佐劑的抗原皮下注射0.05m l/只。實驗對照組分別用PBS液取代抗原,同法皮下注射免疫。末次免疫后第4天,球后動脈放血制血清,-20℃冷凍保存。

1.4 大黃素-BSA的免疫原性及特異性檢測

1.4.1 抗原反應液的制備 分別取大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃酸的標準品各1mg,溶于1.5 ml無水乙醇,加 PBS液至2.5 ml,制成60%乙醇溶解的抗原反應液。

1.4.2 大黃素-BSA的免疫原性檢測 用醋酸纖維素膜雙向免疫擴散法,在96孔板的一排各孔中,分別依次加入用 PBS稀釋的抗血清 1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 和 PBS 對照各 0.2 ml;間隔兩排的對應各孔,加入大黃素抗原反應液（0.4mg/ml）各0.2ml,每組設3個同水平復孔。將醋酸纖維素膜剪成55mm×5mm小條,小條兩端分別插入抗血清和大黃素抗原的對應孔內,置于濕盒內室溫擴散2小時。取出醋酸纖維素膜條,依次用0.5%氨基黑蛋白染液染色1分鐘、PBS漂洗2次、2%冰醋酸水溶液脫色。肉眼觀察醋酸纖維素膜條中段形成沉淀線情況,取最大稀釋度抗血清仍能形成沉淀線作為抗體效價。用SPSS16.0統計軟件,取本組5只鼠抗血清抗體效價的對數值,進行秩和檢驗,判定各組抗原的免疫原性。

1.4.3 大黃素-BSA的特異性檢測 分別取五種蒽醌類化合物的抗原反應液,在96孔板一排的各孔中分別依次加入用60%乙醇稀釋的1∶2、1∶4、1∶8、1∶16直至1∶4 096的倍比稀釋液和空白對照（60%乙醇液）0.2m l,間隔兩排的對應孔加入抗血清（用PBS液稀釋成1∶200）0.2 ml,每組設3個同水平復孔。同1.4.2法進行醋酸纖維素膜雙向免疫擴散,取最大稀釋度抗原仍可見沉淀線作為抗原結合效價。用SPSS16.0統計軟件,取本組5只鼠抗血清與五種蒽醌類化合物反應的抗原結合效價對數值,進行秩和檢驗,判定各組抗血清抗體的特異性。

2 結果

2.1 不同偶聯法的大黃素-BSA結合比 大黃素在450 nm處有典型吸收,而 BSA在此處幾乎沒有吸收。紫外掃描發現兩組大黃素-BSA均在450 nm處有明顯吸收,而經反復換液透析后的最終透析外液在450 nm處吸收峰極低,表明透析袋內容物的450 nm吸收,主要來自大黃素-BSA,而不是游離大黃素所致。取450 nm所測各物質的A值,經兩次回歸計算,得大黃素-BSA 1和大黃素-BSA2的結合比分別為12和13,二者結合比相近。

2.2 兩種偶聯法制備大黃素-BSA的免疫原性 大黃素-BSA1和大黃素-BSA2抗血清與大黃素反應形成的沉淀線見圖1,其抗體效價見圖2,二者有極顯著性差異（P=0.006）。實驗對照組均未見沉淀線形成,大黃素-BSA 1的免疫原性顯著高于大黃素-BSA2。

圖1 兩種偶聯法大黃素-BSA醋酸纖維素膜雙向免疫擴散沉淀線Fig.1 Precipitation of the two Emodin-BSA with doub le immunodiffusion on cellu lose acetatemembrane

圖2 大黃素-BSA1和大黃素-BSA2的大黃素免疫原性Fig.2 Immunogenicity of Emodin of Emodin-BSA1 and E-modin-BSA2

圖3 五種蒽醌類化合物結構圖[1]Fig.3 Five anthraquinone compounds structures

2.3 不同偶聯法制備大黃素-BSA的特異性 結果見表1。重氮化對氨基苯甲酸偶聯法制備大黃素-BSA1的抗血清,與大黃素結合效價較高,與大黃素甲醚和大黃酚呈低度結合,統計學有極顯著性差異（P=0.007）。琥珀酸酐偶聯法制備大黃素-BSA2的抗血清,與大黃素甲醚結合效價較高,而與大黃素和大黃酚的結合效價較低,統計學有極顯著性差異（P=0.009）。兩種抗血清均不與大黃酸、蘆薈大黃素結合,實驗對照組均未見沉淀線形成。

大黃素-BSA1抗血清中以抗大黃素抗體為主,并對大黃素有較強的特異性;大黃素-BSA2抗血清則以抗大黃素甲醚抗體為主,對大黃素的特異性較差,二者有極顯著性差異（P=0.006）。

表1 大黃素-BSA1和大黃素-BSA2抗血清與蒽醌類化合物反應的抗原結合效價Tab.1 Fiveanthraquinone compoundsantigens titer in anti-E-modin-BSA1 serum and anti-Emodin-BSA2 serum

圖4 重氮化對氨基苯甲酸偶聯法連接大黃素-BSA1的結構圖Fig.4 The Emodin-BSA1 structures from p-am inobenzoic acid diazotizition coupling reaction

3 討論

影響半抗原免疫原性的因素,除了結合比外,還與偶聯方法密切相關。重氮化對氨基苯甲酸偶聯法大黃素-BSA1與琥珀酸酐偶聯法大黃素-BSA2的結合比分別為12和13。因為半抗原與BSA連接的結合比在5～20較為適宜,故二者無明顯差異[6]。但實驗結果顯示這兩種抗原對小鼠的免疫原性具有顯著性差異,這可能與不同偶聯法連接大黃素-BSA所形成的半抗原表位構型有關。

重氮化對氨基苯甲酸偶聯法,是先將大黃素與重氮化對氨基苯甲酸反應,在大黃素酚羥基的鄰位或對位引入羧基,再用碳二亞胺法與BSA偶聯[3]。根據大黃素結構（見圖3）及其與重氮鹽偶合反應原理推測:在大黃素2、4、5、7號位均可發生反應,分別生成大黃素-BSA1-1、大黃素-BSA1-2、大黃素-BSA1-3、大黃素-BSA1-4（見圖4）及其兩個或兩個以上部位同時發生反應的產物。這些產物均保留了大黃素6號位酚羥基的特征性結構。因此,用該法制備大黃素-BSA1的大黃素免疫原性較強,主要誘導產生抗大黃素特異性抗體。

圖5 琥珀酸酐偶聯法連接大黃素-BSA2的結構圖Fig.5 The Emodin-BSA2 structures from succinic anhyd ride coup ling reaction

大黃素-BSA1的抗血清中,尚存在少量能與大黃素、大黃素甲醚、大黃酚共同結合的抗體。可能是因大黃素-BSA1-1和大黃素-BSA1-3產物與BSA連接的部位距6號位酚羥基較近,掩蓋了大黃素特征性結構,而表達了大黃素、大黃素甲醚、大黃酚的共同表位構型（見圖3）所致。

琥珀酸酐偶聯法,是先將大黃素的酚羥基與琥珀酸酐反應,生成帶有羧基的大黃素琥珀酸單酯,再用碳二亞胺法與BSA偶聯[2]。大黃素的1、6、8號位酚羥基均可與琥珀酸酐發生反應,分別生成大黃素-BSA2-1、大黃素-BSA2-2、大黃素-BSA2-3（見圖5）及其兩個或三個酚羥基共同發生反應的產物。因1號位和8號位的酚羥基可與羰基形成分子內氫鍵,加上空間位阻效應,使反應活性降低,所以6號位酚羥基最為活潑[1],故推測大黃素-BSA2-1的產量最大。而大黃素-BSA2-1正是利用大黃素6號位酚羥基與BSA連接,即破壞了大黃素6號位酚羥基的特征結構。其表位構型是大黃素、大黃素甲醚、大黃酚的共同結構（見圖3）。因此,用大黃素-BSA2免疫小鼠產生的抗體,主要是能與大黃素、大黃素甲醚、大黃酚共同結合的抗體,對大黃素的特異性不強。

本實驗提示:選擇合適的偶聯方法制備半抗原-載體復合物,是制備抗半抗原特異性抗體的關鍵所在。不同偶聯方法因選擇半抗原的連接基團或部位不同,決定了半抗原表位構型的表達,不僅影響半抗原的免疫原性,更決定其免疫抗體的特異性。在選擇半抗原-載體偶聯法時,首先應保留半抗原的特征性結構,其次還應注意選擇在遠離半抗原特征性結構的部位進行連接,防止半抗原的特征性結構被破壞或被屏蔽而失去特異性。

制備抗大黃素抗體,宜選用重氮化對氨基苯甲酸偶聯法制備大黃素-BSA作免疫原,這樣不僅能提高大黃素的免疫原性,而且還可制備出較高特異性的抗大黃素抗體。

1 匡海學.中藥化學[M].北京:中國中醫藥出版社,2003:74-78.

2 劉文泰.醫學免疫學[M].北京:中國中醫藥出版社,2009:219-226.

3 方 渡.有機化學[M].北京:學苑出版社,2002:384-385.

4 徐修遠,滑 靜,胡建民.氯霉素人工抗原的合成及其結合比的測定[J].中國畜牧獸醫,2005;32（2）:24-25.

5 胥傳來,賀鐵明,王武康.己烯雌酚免疫原的合成及其抗血清制備[J].細胞與分子免疫學雜志,2005;21（2）:65-66.

6 Brian law.Immunoassay[M].A PracticalGuide.London/mew York:Taylor&Francis Ltd,1996:11-31.

[收稿2010-11-24 修回2011-01-26]

（編輯 張曉舟）

Study on the immunogenicity and specificity of different epitope configuration Emodin-BSA

LILi-Hua,LIUWen-Tai,DAIJun,DOUYu-Hong,WANGRu,LIUYan-Chen,PENGYang.HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050091,China

Objective:To study the immunogenicity and specificity of differentepitope configuration Emodin-BSA preparedwith different coupledmethods.Methods:Emodin-BSA1 was synthesizedwith p-aminobenzoic acid diazotizition coupling reaction and Emodin-BSA2 was synthesized with succinic anhydride coupling reaction.Anti-Emodin-BSA sera wereobtained from immunizedm iceusing Emodin-BSA1 and E-modin-BSA2,respectively.The immunogenicity and antibody specificity of anti-Emodin were tested by doub le immunodiffusion on cellulose acetatemembrane.Results:The anti-Emodin antibody titers in anti-Emodin-BSA1 and anti-Emodin-BSA2 serum were 1∶144 0±357.771 and 1∶440±219.089 respectively（P=0.006）.The former combinative titer with Emodin were 1∶184 3.2±457.947,the latter were 1∶8.8±4.382.Conclusion:The epitope configurations of two Emodin-BSA were strikingly different,immunogenicity and specificity existed significant difference.Emodin-BSA1 was ont on ly high immunogenicity but specificity for Emodin aswell.

Antigen-antibody reaction;Double immunodiffusion;Emodin;Hapten-carrier coupling;Epitope

R392.33

A

1000-484X（2011）05-0419-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.008

李麗華（1960年-）,女,學士,教授,主要從事中藥成分分析研究;

及指導教師:劉文泰（1958年-）,男,教授,碩士生導師,主要從事免疫學與中醫藥研究。