人參皂甙對小鼠腹腔巨噬細胞活性的影響及其作用機制初步探討

曹 麗 顧學文 張天一 汪 驊 （揚州大學臨床醫學院,揚州 225001）

人參皂甙對小鼠腹腔巨噬細胞活性的影響及其作用機制初步探討

曹 麗 顧學文①張天一②汪 驊 （揚州大學臨床醫學院,揚州 225001）

目的:觀察人參皂甙（GS）對巨噬細胞的免疫激活作用,探討GS活化巨噬細胞及免疫調節機制。方法:在體外培養的小鼠腹腔巨噬細胞中加入不同濃度的GS后,觀察巨噬細胞一氧化氮（NO）合成及MTT比色法檢測活化后的巨噬細胞對腫瘤細胞殺傷活性的影響;掃描電子顯微鏡（SEM）觀察巨噬細胞的超微結構改變;激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察巨噬細胞表面組織相容性復合體Ⅱ（MHCⅡ）的變化;以特異性熒光探針Fluo-3/AM負載細胞,應用LSCM檢測巨噬細胞內Ca2+濃度。結果:小鼠腹腔巨噬細胞經GS作用后,細胞形態發生活化性改變,殺瘤活性增強,細胞表面MHCⅡ表達增加并增強對H 22細胞殺傷活性;GS作用細胞4小時后,25～200mg/LGS細胞內Ca2+濃度升高,并與藥物濃度呈正相關。結論:GS在體外能激活小鼠巨噬細胞,促進其發揮免疫防御功能,其免疫調節機制可能與細胞內Ca2+濃度升高有關。

人參皂甙;巨噬細胞;一氧化氮;鈣

人參皂甙（Ginsenoside,GS）是傳統中藥人參的主要有效成分之一,對神經、內分泌、免疫、心血管等系統有廣泛的生物學活性作用[1]。研究表明,GS可提高機體免疫功能和抗腫瘤能力[2-4],但其作用機制尚待深入研究。本實驗觀察GS對小鼠腹腔巨噬細胞的活性及腫瘤細胞的影響,探討GS激活巨噬細胞后發揮殺瘤作用時與細胞內游離Ca2+濃度變化的關系,從細胞分子水平研究GS的免疫調節機制,為GS的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器 一氧化氮檢測（酶法）試劑盒（晶美生物工程北京有限公司）;四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Sigma）;Fluo-3 acetoxymethyl ester（Fluo-3/AM,Molecular probe）;清潔級小鼠（南通大學動物實驗中心）;H22肝癌細胞株（中國科學院上海藥物研究所）;GS（南通大學航海醫學研究所）;激光共聚焦掃描顯微鏡（TCS-SP2 Leica.Germany）;掃描電子顯微鏡（S-3400N HITACHI.Japan）。

1.2 細胞制備及培養 按文獻[5]方法進行細胞制備,將所得細胞用含10%滅活小牛血清的RPM I-1640培養液配成密度為1×106ml-1的細胞懸液,加入培養板進行培養。可用免疫組織化學法,經CD68標記細胞來證實,臺盼藍染色證實活細胞數＞95%。

1.3 MTT測定 將收集所得Mφ配成1×106m l-1的細胞懸液接種于96孔培養板,培養24小時后,分別添加GS至所需濃度（終濃度分別為 25、50、100、200mg/L,每個濃度重復3孔,獨立重復3次,以不加藥物組作為陰性對照）,孵育24小時后用完全培養基洗細胞一次,作為效應細胞。取對數生長期H22肝癌細胞為靶細胞,用RPMI1640培養液配成1×105ml-1懸液。按效靶比10∶1接種于96孔培養板。另設單獨靶細胞和單獨效應細胞組,用酶標儀檢測各孔570 nm波長的光密度（OD）值,計算PMφ殺傷活性[6]。

1.4 腹腔巨噬細胞釋放一氧化氮量的檢測 按一氧化氮試劑盒說明書操作,測定NO釋放量。

1.5 SEM觀察 PMφ超微結構 收集經100mg/L GS作用 20小時的 PMφ,經浸洗,固定,再浸洗,后固、漂洗、乙醇梯度脫水,樣品室干燥,離子濺射鍍膜,SEM觀察。

1.6 巨噬細胞MHCⅡ表達 將PMφ以1×106m l-1濃度培養2小時后,用D-Hanks液洗去未貼壁細胞,然后分組培養:25、50、100mg/LGS誘導培養的實驗組和對照組（不加藥物）。20小時后浸洗3次,75%乙醇室溫固定30分鐘,浸洗3次,5%BSA（牛血清白蛋白）封閉,滴加入生物素-抗小鼠MHC-Ⅱ分子抗體（1∶500稀釋）,4℃過夜,浸洗3次,滴加入量子點（QDs）-親和素（Rock land公司）（1∶4）標記的生物素（本室合成）室溫下染色 20～30分鐘,浸洗3次,無熒光甘油封片劑封片,LSCM觀察熒光強度及分布特點。

1.7 細胞內Ca2+濃度的檢測 將巨噬細胞接種于96孔培養板培養24小時后,再將對照組（不加藥物）、GS 給藥組（25、50、100、200 mg/L）培養4小時,用HEPES緩沖液洗3次,加入用HEPES緩沖液稀釋的Fluo-3/AM 0.1m l,37℃孵育45分鐘,HEPES洗3次,再加入HEPES 0.1 m l,37℃孵育30分鐘后置LSCM下觀察,各組均以同一參數迅速掃描3個不同的視野,從各視野中隨機選取20個細胞,計算60個細胞的平均熒光強度用于統計學分析（熒光強度數據為Leica confocal software軟件對掃描圖像進行處理所得）。

2 結果

2.1 腹腔巨噬細胞體外殺瘤活性 隨GS作用濃度的增加,殺瘤活性不斷增強,各濃度組與對照組差異顯著（P＜0.01）,25mg/L組與50mg/L之間差異無顯著（P＞0.05）,其余各濃度組之間差異顯著（P＜0.05）,見表 1。

2.2 腹腔巨噬細胞一氧化氮釋放量 隨GS作用濃度的增加,NO釋放量依次增加,各濃度組與對照組差異顯著（P＜0.01）,各濃度組之間差異均顯著（P＜0.05）,見表1。

2.3 SEM觀察巨噬細胞超微結構

2.3.1 對照組 PMφ細胞呈圓形,形態規則,表面突起少（圖1A）。

2.3.2 GS（100 mg/L）誘導組 PMφ呈不規則形,細胞表面布滿不規則微絨毛,還有一些較長的偽足,向四周伸出（圖1B）。

2.4 腹腔巨噬細胞MHCⅡ的表達

2.4.1 PMφ的MHCⅡ陽性表達率的變化 對照組PMφ的MHCⅡ陽性表達率為（18.60±3.16）%,GS不同濃度（25、50和100mg/L）PMφ的MHCⅡ陽性表達率分別為（35.74±1.73）%、（48.63±1.05）%和（65.45±3.42）%,隨GS作用濃度的升高,PMφ的MHCⅡ陽性表達率逐漸升高,與對照組存在顯著差異（P＜0.01）,各組間相比差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 腹腔巨噬細胞殺傷活性及一氧化氮釋放量（±s,n=3）Tab.1 Release of of NO and killer activity of PMφ（±s,n=3）

表1 腹腔巨噬細胞殺傷活性及一氧化氮釋放量（±s,n=3）Tab.1 Release of of NO and killer activity of PMφ（±s,n=3）

Note:Compared with controlgroup,1）P＜0.01.

GS concentration（mg/L）Kill probability（%）Release ofofNO（mol/L）24.60±5.06 335.60±5.68 25 38.86±1.561） 416.10±7.211）50 42.19±2.791） 448.20±2.351）100 68.55±4.411） 510.11±11.301）200 79.62±5.951） 578.10±6.201）0

圖1 SEM下觀察GS誘導的PMφ超微結構Fig.1 The observation of ultram icrostructure changes of PMφ by SEM

圖2 PMφMHCⅡ分子表達強度及分布Fig.2 The expression of cell surface MHCⅡ

表2 巨噬細胞內Ca2+熒光強度Tab.2 The fluorescence intensity of intercellular calcium in PMφ

圖3 巨噬細胞內鈣離子熒光強度Fig.3 The fluorescence intensity of intercellular calcium in PMφ

2.4.2 PMφ的MHCⅡ表達強度及分布變化 經480 nm波長激發,量子點標記的MHCⅡ分子發綠色熒光,對照組PMφ上MHCⅡ分子熒光多呈點狀、顆粒狀零星分布于細胞膜和胞質,熒光強度弱（圖2A）;經50mg/LGS誘導的PMφ上MHCⅡ分子熒光以較大顆粒樣,呈串珠狀沿胞膜排列,有的呈塊狀分布于胞膜和胞質（圖 2B）;經100mg/L GS誘導的PMφ上MHCⅡ分子呈強熒光物質沿包膜均勻、連續地環狀分布,并向胞質內均勻延伸,甚至覆蓋整個細胞（圖2C）。

2.5 細胞內Ca2+濃度的檢測 LSCM觀察結果可見隨著GS濃度升高,細胞的熒光強度增強。結果見表2、圖3。25mg/L組增加不明顯,與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）,其余GS組與對照組差異顯著（P＜0.01）。

3 討論

GS是人參諸多組份中主要的有效成分。人參對免疫系統的影響已有許多研究,但有關GS對巨噬細胞的影響所知甚少。巨噬細胞是機體中分布廣泛并具有十分活躍的生物學功能的細胞,在啟動及協調免疫應答等方面有著重要作用[7]。本實驗證實在體外GS對小鼠PMφ有直接激活作用,激活的PMφ細胞毒作用增強。經GS刺激20小時的PMφ,對H22腫瘤細胞的細胞毒作用明顯增強,從50、100到200 mg/L組殺傷活性呈緩慢上升趨勢,到200 mg/L組殺瘤率達79.62%。本實驗還發現,經GS作用的PMφ,NO分泌水平增加呈劑量依賴性。NO是一種高活性和不穩定的自由基,是活化的PMφ殺滅腫瘤細胞及病原微生物的主要效應分子之一。實驗結果提示GS增強PMφ細胞毒作用可能與NO有關。

巨噬細胞激活后,誘導表面受體表達,促進殺傷靶細胞,同時活化巨噬細胞分泌的TNF能誘導靶細胞發生凋亡[8]。本研究以GS（100mg/L）刺激巨噬細胞20小時后,掃描電鏡觀察超微結構發現經GS處理的巨噬細胞與對照組細胞相比,細胞處于極度活躍狀態:細胞呈不規則形,表面布滿不規則微絨毛,還有一些較長的偽足,向四周伸出,進一步說明GS對巨噬細胞有激活作用。

MHCⅡ類抗原是巨噬細胞發揮抗原遞呈作用的關鍵性效應分子,巨噬細胞表達MHCⅡ類抗原受多種外來信號的調節,只有活化的巨噬細胞才表達MHCⅡ類抗原,具備抗原遞呈功能[9]。本研究發現經GS處理后小鼠PMφ的MHCⅡ的表達增強,此結果與抗原遞呈分子MHCⅡ在未激活的抗原遞呈細胞上固有低表達,與激活后高表達的既往研究報道相符[10]。結果表明,GS能增強PMφ抗原遞呈能力,與GS的抗腫瘤作用和調節機體的免疫功能密切相關。

以上實驗結果表明,體外培養的小鼠PMφ經GS作用后,細胞毒作用增強,NO分泌水平增加,MHC-Ⅱ的表達增強。Kim等[11]研究表明,脂多糖誘導PMφ表達誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）mRNA的表達,并誘導PMφNO的產生與細胞內游離Ca2+濃度有關。因此,我們推測GS誘導巨噬細胞活化也可能與Ca2+濃度有關。本研究發現GS能激活PMφ而起到免疫增強、殺瘤滅菌的作用;同時用LSCM觀察發現受GS誘導后的PMφ內Ca2+濃度顯著增加,且呈劑量依賴性。細胞內游離Ca2+濃度的變化是細胞生理功能的重要物質基礎,胞內游離Ca2+水平的調節是信號轉導過程中的關鍵環節。GS的作用機制可能是通過增加Mφ內Ca2+濃度的途徑影響細胞的信息轉導,從而激活巨噬細胞,發揮其免疫調節的作用。

1 王衛霞,王 謙.人參皂苷的免疫調節作用及其應用[J].中華中醫藥雜志,2005;（4）:42-44.

2 Kong X,Hu Y,Rui Retal.Effects of Chinese herbalmedicinal ingredientson peripheral lymphocyte proliferation and serum antibody titer after vaccination in chicken[J].International Immunopharmacology,2004;4（7）:975-982.

3 Lee E J,Ko E,Lee Jetal.Ginsenoside Rg1 enhances CD4（+）T-cell activities and modulates Th1/Th2 differentiation[J].International Immunopharmacology,2004;4（2）:235-244.

4 魏翠柏,賈建平,王 芬etal.人參皂苷Rg1及 Rb1對Aβ25-35誘導CHO細胞毒性影響[J].中華中醫藥雜志,2008;23（7）:58-60.

5 Yamamoto Y,K lein TW,TomiokaMetal.Differential effectsof granulocyte/macrophage colony-stimulating factor（GM-CSF）in enhancing macrophage resistance to Legionella pneumophila vs Candida albicans[J].Cellular Immunology,1997;176（1）:75-81.

6 李淑艷,楊秀珍,楊鳳坤.MTT法檢測CIK細胞的體外殺瘤活性[J].齊齊哈爾醫學院學報,2003;24（1）:3-4.

7 Melendez A J,Ibrahim F B.Antisense knockdown of sphingosine kinase 1 in human macrophages inhibits C5a receptor-dependent signal transduction,Ca2+signals,enzyme release,cytokine production,and chemotaxis[J].JImmunol,2004;173（3）:1596-1603.

8 Allenbach C,Zufferey C,Perez Cetal.Tacchini-Cottier F.Macrophages induce neutrophilapoptosis throughmembrane TNF,a processamplified by Leishmaniamajor[J].J Immunol,2006;176（11）:6656-6664.

9 孫泉紅,彭 景.MHC-Ⅱ類分子表達調控的研究進展[J].生理科學進展,2004;35（1）:25-28.

10 龔非力.醫學免疫學[M].第2版.北京:科學出版社,2005:193-196.

11 K im Y,Moon JS,Lee K Setal.Ca2+/calmodulin-dependent protein phosphatase calcineurinmediates the expression of iNOS through IKK and NF-kappaB activity in LPS-stimulatedmouse peritonealmacrophagesand RAW 264.7 cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2004;314（3）:695-703.

[收稿2010-12-04 修回2011-02-14]

（編輯 許四平）

Effects of ginsenoside on activity ofm ice peritokinealmacrophage and initial study on mechanism of its function

CAOLi,GUXue-Wen,ZHANGTian-Yi,WANGHua.ClinicalMedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou225001,China

Objective:To study effects of Ginsenoside on activity ofmacrophage in vitro and further investigate themechanism of Ginsenoside onmaorophage activation and immunomodulation.Methods:By adding different concentrations of GS into cultured mice peritoneal macrophage in vitro,the influenceofGSon the synthesis ofnitrooxide（NO）and killer activity of tumorcellswereobserved.Themorphological changes ofmacrophagewere viewed by Scan Electron Microscope.The exp ression of cell surface MHC-Ⅱwas measured by Laser Scanning ConfocalMicroscope（LSCM）.The cellwas loaded with specificity fluorescent probe Fluo-3/AM.The intercellular calcium concentration and changesweremeasured by LSCM.Results:GS significantly increased NO synthesis,enhanced the effects ofmouse peritonealmacrophages on killing carcinoma cells and MHC-Ⅱ molecule expression were found to be increased.With 25-200mg·L-1GS exposure for 4 h,intercellular calcium concentration was increased,and revealed a positive correlation between the increaseofCa2+and the concentrationofGS.Conclusion:GS can activatemice peritonealmacrophage in vitro,and contribute to its immunomodulatory function.Themechanism of immunomodulatory effectmay be related to the increaseof intracellular Ca2+inmicemacrophage.

Ginsenoside;Peritonealmacrophage;Nitro oxide;Ca2+

R392.12

A

1000-484X（2011）05-0423-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.009

①通訊作者,E-mail:yzgxw@yahoo.com.cn

②南通大學神經再生重點實驗室,南通226001

曹 麗（1978年-）,女,碩士,住院醫師,主要從事免疫和腫瘤病理研究。

·神經內分泌與免疫·