禽多殺性巴氏桿菌OmpA DNA疫苗免疫效果的研究①

宮 強 王帥濤 秦翠麗 牛明福 程 茗 侯玉澤 張勇法 孫曉菲

（河南科技大學,洛陽 471003）

禽多殺性巴氏桿菌OmpA DNA疫苗免疫效果的研究①

宮 強 王帥濤 秦翠麗 牛明福 程 茗 侯玉澤 張勇法 孫曉菲

（河南科技大學,洛陽 471003）

目的:研究禽多殺性巴氏桿菌OmpA DNA疫苗在雞體內誘導的免疫保護效果。方法:PCR擴增禽多殺性巴氏桿菌的ompa基因片段,克隆入pcDNA3.1（+）上,構建重組質粒pOMPA,體外轉染SP2/0細胞,RT-PCR和免疫熒光試驗檢測目的基因的轉錄及表達情況。動物免疫共分四組:pOMPA組、弱毒疫苗組、pCDNA3.1（+）空載體組和PBS對照組,每組15只4周齡雞,除弱毒疫苗組外其他三組均肌注免疫三次,每次間隔兩周,弱毒疫苗組僅首免時肌注1羽份/每只雞。間接ELISA檢測免疫后血清特異性抗體水平,MTT法檢測免疫雞外周血淋巴細胞增殖情況,雙抗夾心ELISA檢測IFN～γ分泌情況,強毒攻擊,計算免疫雞存活數目及保護率。結果:體外轉染檢測結果表明pOMPA可在體外培養的細胞中表達目的蛋白。動物免疫后,DNA疫苗組和弱毒疫苗組血清抗體水平持續上升,與兩對照組相比差異極顯著（P＜0.01）,且弱毒疫苗組血清抗體水平明顯高于DNA疫苗組（P＜0.05）。經提取的外膜蛋白（Omps）誘生后,兩疫苗組的SI值極顯著高于pCDNA3.1（+）組和PBS免疫組（P＜0.01）,兩疫苗組之間則無差別。兩疫苗組免疫雞外周血淋巴細胞產生的IFN-γ極顯著高于兩對照組（P＜0.01）。強毒攻擊后DNA疫苗組和弱毒疫苗組的保護率分別為60%和73.3%。結論:成功構建了禽多殺性巴氏桿菌OmpADNA疫苗,該疫苗為動物提供一定的免疫保護力,但不夠理想。

禽多殺性巴氏桿菌;OmpA DNA疫苗;免疫應答;保護效果

禽霍亂亦稱為禽出血性敗血癥,是由禽多殺性巴氏桿菌病引起的多種禽類的傳染病,目前仍是威脅我國養禽業健康發展的重大疫病之一。由于該病發病急、死亡快、治療不及時會造成家禽大量死亡,據統計,我國每年因禽霍亂死亡的雞幾乎可達家禽疫病死亡數的50%[1]。對于該病的控制措施目前主要采用的仍是口服抗菌素類藥物,如青霉素、鏈霉素、土霉素等,但抗菌藥物長期應用易導致病原菌產生耐藥性,且可能會對禽體產生明顯毒害作用,蛋雞用后產蛋率會明顯下降,從而降低了經濟效益。因此,為防患于未然,從根本上控制本病,必須應用有效的疫苗進行預防。

預防禽多殺性巴氏桿菌病的疫苗主要有弱毒疫苗和滅活疫苗兩種,但禽多殺性巴氏桿菌抗原結構較為復雜,且易發生變異,導致弱毒疫苗的免疫效果并不理想。現有的市售弱毒苗免疫期較短、保護力較低、副作用偏大,應用不當會引起產蛋雞的產蛋率下降甚至會引起該病的流行[2]。而滅活苗的免疫效果又弱于弱毒活疫苗,因此,研制禽霍亂新型疫苗勢在必行。新型疫苗包括重組亞單位疫苗、DNA疫苗、活載體疫苗等。自1990年Wolff發現DNA疫苗以來,因其具有誘導全面免疫應答的能力,已成為疫苗研究領域的熱點,受到了全世界的廣泛關注,被譽為第三代疫苗。人們已對多種動物傳染病如NDV、ILT、AIV等的DNA疫苗進行了深入研究,然而,目前針對多殺性巴氏桿菌病新型疫苗的研究主要集中在重組亞單位疫苗上,且大多針對于豬巴氏桿菌病,禽霍亂DNA疫苗的研究則相對較少[3-7]。

本研究以禽多殺性巴氏桿菌外膜蛋白之一OmpA的編碼基因構建了相應的DNA疫苗pOMPA,導入哺乳動物細胞中進行了表達,并通過動物實驗檢測了該疫苗的免疫保護效果,為研制新型禽霍亂疫苗提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和細胞 禽多殺性巴氏桿菌CVCC474菌株購自中國獸醫藥品監察所;禽多殺性巴氏桿菌弱毒活疫苗為齊魯動物保健品有限公司產品;大腸桿菌感受態細胞DH5α、SP2/0細胞為本實驗室保存。

1.1.2 實驗動物 1日齡雛雞購自河南省實驗動物中心。

1.1.3 主要試劑 真核表達載體pCDNA3.1（+）為本實驗室保存;限制性內切酶、連接酶為MBI公司產品;HRP標記的兔抗雞IgG、FITC標記的山羊抗兔IgG購自北京希凱創新科技有限公司;RPMI1640液體培養基為Sigma公司產品;脂質體2000為Invitrogen公司產品;雞IFN-γ檢測試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司;MTT購自上海華舜生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA疫苗的構建 設計合成禽多殺性巴氏桿菌ompa基因序列引物,上游含有KpnⅠ位點,下游含BamHⅠ位點。以全基因組為模板,PCR擴增該基因,回收后連接T載體,雙酶切后亞克隆到真核載體pcDNA3.1（+）的相應位點,構建重組質粒pOMPA,即OmpA-DNA 疫苗 。

1.2.2 禽巴氏桿菌外膜蛋白抗血清的制備 超聲波裂解法提取禽多殺性巴氏桿菌總外膜蛋白（Omps）[8],Bradford法測定蛋白濃度。加入礦物油乳化成疫苗免疫兔子,抗原含量為2mg/m l,每只兔注射1m l,采用背部多點注射,共免疫三次,每次間隔2周,采血檢測抗體效價后備用。

1.2.3 DNA疫苗的轉染及檢測 將SP2/0細胞傳代于24孔細胞培養板中,待細胞密度達80%左右時取脂質體2000和重組質粒pOMPA在250μl細胞培養液中充分混勻。室溫作用20～30分鐘,加入800μl新鮮的完全培養液,混勻后加入細胞培養板中,設轉染空載體pcDNA3.1（+）的細胞為陰性對照。37℃5%CO2培養48～72小時后收獲細胞以RT-PCR和間接免疫熒光檢測目的基因的轉錄及其表達情況。

1.2.4 動物免疫 1日齡非免疫雛雞共60只,飼養至四周齡時隨機平均分為四組,即pOMPA組、pCDNA 3.1（+）組、弱毒活疫苗組及PBS對照組。重組質粒體外轉染表達后,堿裂解法大量制備質粒pOMPA和pCDNA3.1（+）,PEG法純化,溶于1×PBS（pH 7.2）中,分光光度計測定其濃度和純度并用上述PBS調整濃度為1μg/μl,進行動物免疫。DNA疫苗組和空載組采用肌肉注射,每只雞200μl,PBS對照組每只肌注200μl1×PBS（pH 7.2）,各組均免疫三次,每次間隔兩周。弱毒活疫苗組僅于首免時肌注1羽份/每只雞。

1.2.5 間接ELISA試驗 一免后每周采血,分離血清,-20℃保存待檢。以禽多殺性巴氏桿菌菌懸液為包被抗原,包被濃度為109個/ml,室溫濕盒內包被過夜。用5%的BSA封閉后加入1∶100倍稀釋的待檢血清,37℃濕盒內作用1.5小時后加入HRP-兔抗雞IgG作用1.5小時,加入OPD暗室內顯色10分鐘后用2mol/LH2SO4終止反應,在OD490處測定吸收值以確定免疫雞血清抗體水平,共檢測6周。

1.2.6 淋巴細胞增殖試驗 各免疫組分別于一免2周、二免2周和三免2周時對免疫動物進行心臟采血,分離外周血淋巴細胞,細胞計數后調整濃度為1×107個/ml。96孔細胞培養板每孔加入50μl細胞懸液。試驗孔和陰性對照孔各設3個重復,試驗孔每孔加入50μl 20μg/m l提取的巴氏桿菌外膜蛋白,陰性對照孔每孔加入50μl RPM I1640培養液,置37℃,5%CO2培養箱培養 60小時后,每孔加入5 mg/mlMTT 10μl,繼續培養3小時。然后每孔加100 μl SDS-HCl,繼續作用2小時終止反應,測定OD570吸光值 ,計算 :刺激值（SI）=OD（試驗孔）/OD（陰性對照孔）[9]。

1.2.7 IFN-γ檢測 分別于初免2、4和6周后制備濃度為1×107個/m l的外周血淋巴細胞。以Omps進行刺激,37℃5%CO2培養箱中培養60小時后,吸取培養上清離心收集后-20℃保存。按照檢測試劑盒制作標準曲線,對各組免疫雞分泌的IFN-γ進行檢測。

1.2.8 動物攻毒試驗 第三次免疫2周后,以禽多殺性巴氏桿菌強毒株CVCC474攻毒,攻毒劑量為5 LD50/只,觀察2周,記錄各組試驗動物的死亡數量,計算各疫苗組的保護率。

2 結果

2.1 體外表達結果 提取轉染有重組質粒和空載體的細胞總RNA,進行RT-PCR擴增,結果表明,轉染了pOMPA的細胞中擴增出了目的片段,而空載體轉染的細胞中未擴增出相應片段（圖1A）,說明目的基因在該細胞中進行了轉錄。間接免疫熒光分析結果也表明,轉染了重組質粒的細胞在倒置顯微鏡下可見到熒光出現,而空載體轉染的細胞中則無熒光（圖1B、C）,表明該重組質粒在哺乳動物細胞中獲得了表達。

圖1 pOMPA轉染的RT-PCR（A）和間接免疫熒光檢測（B、C）Fig.1 The Results of RT-PCR（A）and indirect immunofluorescent test（B,C）

2.2 ELISA抗體檢測結果 以間接ELISA法對免疫后雞血清中的抗體水平進行檢測。結果pOMPA組和弱毒活疫苗組抗體水平呈現逐漸上升趨勢,與空載體和PBS對照組相比差異極為顯著（P＜0.01）,兩對照組血清抗體水平則始終維持在較低水平。DNA疫苗組雖經3次免疫,但其檢測到的抗體水平卻仍低于弱毒活疫苗免疫組（P＜0.05,圖2）。

2.3 MTT檢測結果 分別于三次免疫后兩周時,心臟采血制備免疫雞外周血淋巴細胞懸液,以禽多殺性巴氏桿菌Omps進行刺激,MTT法檢測其增殖情況。結果初免后各組的刺激值差別不大,二免和三免后弱毒疫苗組和pOMPA組的SI值極顯著高于兩對照組（P＜0.01）,但兩疫苗組之間則幾乎無差異（P＞0.05,圖3）。

2.4 IFN-γ檢測結果 一免2、4和 6周后,采取免疫雞血,制備外周血淋巴細胞懸液,以Omps為刺激物進行誘導,收集上清,檢測IFN-γ的分泌量。結果如圖4,一免后各組分泌的IFN-γ雖有差別,但差異不明顯（P＞0.05）;二免和三免后DNA疫苗組和弱毒疫苗組免疫雞外周血淋巴細胞分泌的IFN-γ的量極顯著高于兩對照組（P＜0.01）,且pOMPA組的分泌量稍高于弱毒疫苗組,但兩者差別不大（P＞0.05）。

2.5 免疫保護效果檢測 免疫動物于三免兩周后以禽多殺性巴氏桿菌強毒進行攻擊,觀察兩周內的死亡數。結果兩對照組免疫雞幾乎全部死亡,而DNA疫苗組和弱毒活疫苗組死亡雞較少,且前者死亡雞數目多于后者,結果如表1所示。

圖2 血清中抗體的動態變化結果Fig.2 The p rofile of serum antibody

圖3 MTT試驗結果情況（SI,±s）Fig.3 The SI value of lymphocytes proliferation from immunized chickens（SI,±s）

圖4 IFN-γ分泌情況Fig.4 The level of IFN-γsecred by peripheralblood lymphocytes from immunized chickens

表1 攻毒試驗結果Tab.1 Protection of immunized chickens against lethal challenge with avian Pasteurellamuhocida

3 討論

病原菌的外膜蛋白成分（Omps）不僅在細菌的營養攝取、代謝物質的運輸、細菌正常形態的維持以及物質的合成等方面起著重要的作用,而且還具有一定的免疫原性[10,11]。對其深入研究將有助于明確其在病原菌的致病和免疫過程中的作用,為研制相應的新型疫苗奠定基礎。目前已有研究表明,Omps在保護禽多殺性巴氏桿菌感染方面起著重要的作用[12]。禽多殺性巴氏桿菌的外膜蛋白包括主要蛋白和微量蛋白兩種,主要蛋白包括OmpA和OmpH等。已有研究表明多殺性巴氏桿菌的OmpA抗體能夠為機體提供一定的保護[13],但也有研究表明OmpA蛋白雖能誘導實驗動物產生較高水平的抗體應答,但不能提供足夠的保護力[14]。因此,多殺性巴氏桿菌外膜蛋白A的免疫保護效果還沒定論,而且,目前還未見有OmpA DNA疫苗的研究報道。

本實驗以禽多殺性巴氏桿菌全基因組為模板,擴增了主要外膜蛋白基因ompa,并構建了DNA疫苗pOMPA,體外轉染檢測了目的基因的轉錄和表達情況。結果表明構建的pOMPA可在哺乳動物細胞中表達目的蛋白,從而為進一步研究該疫苗的免疫保護效果奠定了基礎。

抗體應答在動物抗多殺性巴氏桿菌感染的過程中具有重要的作用,亞單位疫苗則可誘導機體產生較高水平的抗體,因此人們對此類疫苗的研究較為深入[15,16]。然而,目前已知細胞免疫應答在抗多殺性巴氏桿菌免疫中也具有舉足輕重的作用,而DNA疫苗則可有效地誘導細胞免疫反應[17]。本研究同時對OmpA-DNA疫苗免疫后誘導的體液和細胞免疫應答進行了檢測。DNA疫苗和弱毒活疫苗免疫后均可誘導機體產生較高水平的抗體,但由于試驗所用包被用抗原為禽多殺性巴氏桿菌全菌體,其成分較為復雜,抗原之間可能會存在競爭吸附,使包被于酶標板上的各成分的含量均相對較少,故檢測到的針對于單一抗原的抗體水平不是很高,因此DNA疫苗組的抗體檢測結果低于弱毒疫苗組。若要提高OmpA-DNA疫苗的檢測效果可用提取的禽多殺性巴氏桿菌外膜蛋白Omps作為包被抗原進行ELISA試驗檢測,或者構建ompa基因的原核表達載體,獲得純化的重組蛋白后以其作為包被抗原進行檢測。

MTT試驗是檢測細胞免疫功能指標的常用方法之一,常通過淋巴細胞對ConA刺激后的轉化的程度來衡量T淋巴細胞的應答功能。但ConA作為一種非特異性有絲分裂原,其誘導的淋巴細胞增殖水平較易受到環境因素的影響,因而本研究采用禽多殺性巴氏桿菌Omps為特異性刺激原,檢測經其誘導后免疫雞外周血淋巴細胞的增殖水平。結果表明二免和三免后弱毒疫苗組和pOMPA組的SI值明顯高于對照組。本研究同時對疫苗免疫后誘導的Th1型細胞因子IFN-γ的分泌量進行了檢測。結果兩疫苗組均可刺激機體產生較高水平的IFN-γ,且兩對照組分泌的水平則很低。因此,MTT試驗和IFN-γ檢測試驗表明本研究構建的pOMPA疫苗同弱毒活疫苗均可有效地誘導機體產生一定的細胞免疫應答。動物攻毒保護試驗是評價疫苗保護效果的最準確的指標之一,三次免疫后以強毒株對免疫雞進行攻擊,結果表明DNA疫苗可為免疫動物提供60%的保護力,弱毒活疫苗的保護率則可達73.3%,因此,本研究構建的禽多殺性巴氏桿菌OmpA-DNA疫苗在對抗禽霍亂方面有一定的效果,但不及傳統的弱毒活疫苗理想。

本研究成功構建了禽多殺性巴氏桿菌OmpADNA疫苗pOMPA,動物實驗結果表明該疫苗可誘導實驗動物產生一定水平的體液和細胞免疫應答,并可為免疫動物提供一定的保護力,但效果不及傳統弱毒活疫苗,其原因可能在于ompa基因僅為禽多殺性巴氏桿菌眾多保護性抗原基因之一,因此OmpADNA疫苗所含抗原表位不夠豐富,不能誘導機體產生足以抵抗強毒攻擊的保護力。可嘗試利用ompa基因與禽多殺性巴氏桿菌的其他保護性抗原基因如omph、plpb等構建多基因融合DNA疫苗或多價聯合DNA疫苗,從而為進一步研究禽霍亂高效新型疫苗奠定基礎。

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[收稿2010-09-27 修回2010-10-18]

（編輯 許四平）

The immune efficacy ofOmpA-DNA vaccine against avian pasteurella multocida

GONGQiang,WANGShuai-Tao,QINCui-Li,NIUMing-Fu,CHENGMing,HOUYu-Ze,ZHANGYong-Fa,SUNXiao-Fei.HenanUniversityofScience&Technology,Luoyang471003,China

Objective:To researchon protective immunity ofOmpA-DNA vaccine against fow l cholera in chickens.Methods:Theom pa gene fragmentamplified by PCR from avian Pasteurellamultocidawas cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1（+）,and the recombinantplasmid pOMPA was constructed.Then the recombinantp lasmidwas transfected into SP2/0 cells in vitro.The transcription and expression of targetgenewereanalyzed by RT-PCR and indirect immunofluorescence.Fourgroupsof chickensnamed pOMPA,attenuated live vaccine,pCDNA3.1（+）and PBSwere vaccinated with the DNA vaccine,attenuated live vaccine,control vector and PBS respectively.The serum antibodieswere detected by indirect ELISA.The peripheral blood lymphocyte（PBLC）p roliferation and secreted of PBLCwere tested byMTT.The immunized chickenswere challengedwith virulentof avian Pasteurellamu ltocidaon week 2 post the third immunization,and the protection ratewas counted.Results:RT-PCR and indirect immunofluorescence showed that the ompagene could be transfected into SP2/0 cells in vitro and the target proteinwas expressed.Indirect ELISA showed that the levels of antibodies in DNA vaccine group and attenuated live vaccine group weremost significantly higher than thoseof the othergroups（P＜0.01）,and thatof the former lower than thatof the latter（P＜0.05）.MTT experiments indicated that the SIvalue inducedwith avian PasteurellamultocidaOmps in the two vaccinegroupswere significantly higher than those of pCDNA3.1（+）and PBSgroups（P＜0.01）,and the two vaccines groupswere indiscriminate.The IFN-γexperiments displayed that the levels of IFN-γinduced withOmps in thegroups of pOMPA and attenuated vaccineweremostly higher than those of the control groups（P＜0.01）.The protection rate of DNA vaccineand attenuated live vaccinewere 60%and 73.3%respectively.Conclusion:TheOmpA-DNA vaccine against fow l cholerahas been constructed successfully.The DNA vaccine cou ld enhance the immunity level and the p rotectiveeffectagainst fowl cholera,but is barely satisfactory.

AvainPasteurellamuhocida;OmpA DNA vaccine;Immune response;Protective effect

S855.1

A

1000-484X（2011）05-0454-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.017

①本文為河南省重點科技攻關計劃項目（092102110162）

宮 強（1979年-）,男,博士,主要從事獸醫分子生物學與免疫學研究,E-mail:qianggong79@yahoo.com.cn。