EAE大鼠臨床病變與胸腺損傷關系探討①

袁宏宇 董 梅 劉瑞春 郭 力 郭艷蘇 吳東霞 陳麗萍

（河北醫科大學第二醫院神經內科,石家莊 050000）

EAE大鼠臨床病變與胸腺損傷關系探討①

袁宏宇 董 梅 劉瑞春 郭 力 郭艷蘇 吳東霞 陳麗萍

（河北醫科大學第二醫院神經內科,石家莊 050000）

目的:研究EAE大鼠發病后不同時期臨床病變與胸腺損傷之間關系。方法:觀察正常及EAE發病后3天、5天及恢復期大鼠臨床神經功能狀態,測量各組大鼠體重、胸腺重量、計算胸腺指數,光鏡下觀察腦組織及胸腺病理變化,采用流式細胞術檢測各組胸腺細胞凋亡率。結果:發病3天及5天大鼠肢體癱瘓,神經功能評分分別為2.60±1.22和1.50±0.512,兩組之間無統計學差異。光鏡HE染色顯示發病3天胸腺顯著萎縮,淋巴細胞數減少,發病5天較3天細胞數量有所恢復,恢復期組細胞數明顯增多;發病3天腦組織大量炎細胞浸潤,發病5天有多數袖套樣改變,血管周圍圍繞較多炎細胞,恢復期炎細胞明顯減少。發病3天組胸腺指數較其他組明顯下降（P＜0.05）,其余組胸腺指數相比無統計學意義（P＞0.05）。流式細胞術顯示發病3天大鼠胸腺細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）,其他組相比無統計學意義（P＞0.05）。結論:發病3天大鼠臨床神經功能評分及胸腺損傷均較嚴重,大量胸腺細胞凋亡。隨病情發展,胸腺呈現先萎縮、后恢復的動態過程,早于臨床癥狀的恢復,說明胸腺具有自我恢復性,可以促使疾病緩解,可能參與EAE的發病過程。

實驗性變態反應性腦脊髓炎;臨床病變;胸腺;凋亡;病理

多發性硬化（Multiple sclerosis,MS）是一種以中樞神經系統白質脫髓鞘為主要病理特征的自身免疫性疾病,主要由CD4+T細胞介導,其病因和發病機制尚未闡明。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（Experimentalallergic encephalomyelitis,EAE）是MS公認的動物模型,MS許多方面的進展是通過對EAE的研究實現的。胸腺是重要的中樞免疫器官,是CD4+T細胞的發源地。胸腺T細胞通過凋亡途徑去除無自身免疫耐受的細胞,以維持機體的穩定。研究表明胸腺與MS有較大關系:去除胸腺的EAE小鼠失去了病情自然恢復能力,而存在胸腺的EAE小鼠病情可以緩解[1]。

本研究通過建立EAE模型,采用組織病理學、流式細胞技術、電鏡等實驗方法觀察EAE大鼠不同發病時期胸腺的形態學、凋亡變化規律、及與大鼠神經功能障礙、腦組織病理學改變之間的關系,探討胸腺損傷與EAE大鼠臨床病變發生發展的關系及可能的作用,為進一步的實驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立及分組 從河北醫科大學實驗動物中心選購約6～8周齡Wistar大鼠 70只[SCXK（冀）2003212003],雌性,體重 180～200克。用新鮮豚鼠的全脊髓制成勻漿加上完全弗氏佐劑（CFA）,佐劑中所含卡介苗量為6mg/m l,乳化后按0.5m l/只分別于大鼠四足墊內及背部皮下注射,免疫動物[2]。實驗動物分四組,正常組、發病3天組、發病5天組、恢復期組,每組12～15只。

1.2 神經功能評分 所有實驗動物自免疫當日起觀察大鼠的精神狀態、反應是否靈敏,進食水情況,大小便情況、尾部與肢體力量情況等。參照Kono[3]提出的標準,將發病程度分為5級:Ⅰ級動物尾部無力;Ⅱ級尾部無力+肢體無力;Ⅲ級肢體輕度麻痹;Ⅳ級肢體嚴重麻痹,被動翻身后不能復原;Ⅴ級瀕死狀態,選取發病程度Ⅱ級及其以上,按實驗設計取材。

1.3 標本采集 動物稱重后麻醉并打開胸腔,充分暴露出上端胸骨下呈白色的胸腺,從根部將胸腺完整摘下,稱重,將胸腺分別固定于4%中性甲醛或4%戊二醛中,進行光鏡、電鏡檢查;同時取腦組織固定于4%多聚甲醛中,進行光鏡檢查,以HE染色評估炎癥病變。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析,計量資料的數據用±s表示,神經功能評分采用Mann-Whitney U檢驗;胸腺指數,凋亡率多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和SNK-q檢驗。檢驗水準取α=0.05。

2 結果

2.1 臨床表現及神經功能評分 EAE模型組的大鼠免疫后出現精神萎靡、食欲減退、皮毛不光滑、體重下降,于免疫后第16.30±4.10天發病,出現尾部張力降低、尾部無力,繼之出現后肢、四肢無力、麻痹,大小便失禁,少數表現為僅雙前肢的無力或癱瘓,無因病情危重而死亡。臨床癥狀評分第3天組與第5天組比較無統計學意義（見表1）。

2.2 組織病理 正常組大鼠神經組織病理學未見異常,發病3天大鼠腦實質內有大量炎細胞浸潤,彌散分布,部分錐體細胞形態略變圓頓,發病5天大鼠腦組織內可見多數“血管袖套”結構,周圍有明顯的炎細胞圍繞,恢復期大鼠腦組織可見少數散在血管袖套,周圍少量炎細胞浸潤,不同發病時期病理改變與其臨床癱瘓程度一致,符合臨床特點（見圖1）。

2.3 胸腺指數 即大鼠胸腺質量/大鼠體質量,第三天組大鼠胸腺指數有顯著升高（P＜0.05）,其余各大組鼠胸腺指數與正常組相比無統計學意義（P＞0.05）,（見表2）。

表1 各組大鼠神經功能評分Tab.1 Nervous functional score of different groups

圖1 不同時期EAE大鼠HE染色顯示炎癥改變（HE,×100）Fig.1 Inflammatory changes in brain of normaland EAE rats（HE,×100）

2.4 胸腺光鏡結構 正常組大鼠胸腺結構正常,皮髓質分界清楚,皮質部染色較深的淋巴細胞密集,核呈藍紫色,髓質部染色淺的上皮網狀細胞較多,EAE各組大鼠胸腺細胞結構都發生不同程度的改變,淋巴細胞和上皮網狀細胞均遭到破壞,第三天組呈現顯著的胸腺萎縮,皮質明顯變薄,淋巴細胞數減少,細胞松散,凋亡細胞數增多,核染色質濃縮,核固縮。而第五天組與第三天組比較凋亡細胞明顯減少,第三天組和恢復組比較有明顯差異（見圖2）。

2.5 流式細胞術檢測 結果顯示各組細胞凋亡率,第3天組大鼠胸腺細胞凋亡率有顯著升高（P＜0.05）,其余兩組胸腺細胞凋亡率相比無統計學意義（P＞0.05,見表3）。

表2 各組胸腺指數Tab.2 Thymus index of each group

圖2 各組胸腺結構（HE染色,×400）Fig.2 Thymus structure of EAE（HE,×400）

表3 胸腺細胞凋亡率Tab.3 Apoptosis rate of thymus cells

3 討論

MS是以CD4+T細胞介導為主的自身免疫性疾病,基本病理改變為白質炎性脫髓鞘、軸索損傷、膠質細胞增生等,好發于年輕女性,大多數患者表現為反復發作的神經功能障礙,嚴重者可以致殘,病因和發病機制尚未闡明。

胸腺是重要的中樞免疫器官,是T細胞分化成熟的場所,胸腺細胞經過陽性選擇和陰性選擇分化發育成少量只表達CD4+或CD8+的單陽細胞,即成熟T細胞,使自身具有MHC限制性和自身免疫耐受性,從胸腺遷出后移居到血液和周圍淋巴器官中,發揮免疫調節作用。而大量未成熟T細胞則在分化中通過凋亡機制被清除,胸腺細胞整個發育過程自始至終受到細胞凋亡機制的監控,如果該機制出現紊亂,則將導致自身免疫病發生。因此,對胸腺形態改變及細胞凋亡的研究能體現胸腺的功能狀態。MS的發病機制尚不清楚,發生在免疫器官內的反應尚未可知。MS患者MHCⅡ型限制性由來自胸腺、外周和腦部的抗原呈遞細胞（APC）決定[4]。有關MS患者胸腺結構和功能變化的研究及對MS發病機制及神經功能障礙影響的報道逐漸增多,其作用仍有待于進一步研究。

胸腺對各種刺激非常敏感,應激反應、激素、藥物及各種疾病均可致其迅速退化而發生病理改變[5]。一些學者研究發現在MS和EAE發病過程中涉及胸腺結構和功能的改變,并可能對疾病的發生和發展產生一定的影響。胸腺中持續的初始T細胞輸出是保證循環中自身反應性T細胞受控制的必要條件。Duszczyszyn[6]觀察了初始T細胞在RRMS患者體內的動態平衡,表明患者早期既有胸腺受累,伴有相應的外周T細胞增殖反應的代償性自穩狀態破壞,使患者容易發生自身免疫性疾病。Cavallotti[7]觀察大鼠EAE胸腺的超微結構,顯示了許多與EAE發病機理相關的變化,如胞漿內空泡增多,線粒體、粗面內質網等變化及細胞凋亡和壞死的增加。由此表明MS患者胸腺結構和輸出T細胞功能均下降,可能會對疾病產生一定作用。Tsunoda等[8]研究發現,在SW小鼠RR-EAE中有胸腺萎縮,T、B細胞缺失和大量凋亡。Zimecki等[9]研究發現給EAE大鼠肌肉內注射胸腺提取物（TFX○R）及其六肽片段可以明顯減輕臨床表現、免疫學、病理學和超微結構改變,提示TFX○R及其來源的片段對神經變性疾病如MS有潛在的治療作用。CD4+CD25+Foxp3（+）T調節性T細胞（Treg）的顯著特征是對具有免疫活性的自身反應性T細胞具有抑制作用。研究表明胸腺在口服免疫耐受中具有誘導產生Treg、清除自身免疫性T細胞和輸送初始T細胞的作用[10]。除來自胸腺的Treg細胞,外周來源的Treg在維持免疫平衡中也有重要作用,提示T細胞疫苗接種在MS和風濕性關節炎中具有治療前景[11]。Anderton[12]發現缺乏LFA-1（-/-）的小鼠發生EAE加重,可能是與胸腺中Treg產生的數量的減少、對自身抗原免疫反應的放大和T細胞對CNS的浸潤所致。Chen等[1]研究表明EAE發病后胸腺處于一種激活狀態,通過增加胸腺間質細胞中IL-7的表達,加速胸腺細胞中Treg細胞的分化和增殖,使輸出的Treg細胞增加,這個過程可以抑制疾病的進展并促進功能的恢復,提示胸腺在EAE中有自我調節的功能。Broux[13]最近研究發現自身穩定T細胞受體即IL-7R的基因型與MS相關。IL-7R多態性能影響胸腺中T細胞的發育和自穩平衡,導致與MS患者疾病進展一致的免疫調節的改變。Korporal[14]研究表明 IFN-β治療MS可以上調Treg細胞的抑制功能,與增加胸腺來源的初始T細胞和降低記憶T細胞一致,達到維持Treg細胞的自穩平衡狀態。

本實驗動態研究了不同發病時期EAE大鼠臨床神經功能障礙、腦組織及胸腺病理學改變、胸腺指數、胸腺細胞凋亡等,探討胸腺損傷與臨床病變之間發生發展的關系,作為研究胸腺在EAE發病中的作用及可能的機制的基礎。胸腺指數在一定程度上反映了機體免疫功能的強弱,當胸腺萎縮后培育T淋巴細胞成熟的內分泌微環境遭到破壞,我們發現在EAE發病早期即發病3天時胸腺就發生嚴重病變,胸腺明顯萎縮變小、胸腺指數下降和大量胸腺細胞凋亡,表明胸腺結構和功能均受損傷,與大鼠嚴重的臨床表現和較高的神經功能評分一致;但胸腺有很強的自我恢復能力,發病5天時胸腺迅速恢復形態,凋亡細胞也相應減少,與發病3天的檢測結果差異具有統計學意義,而此時臨床表現及神經功能評分均改變不明顯,與發病3天時臨床指標比較無統計學意義;恢復期胸腺形態及細胞凋亡水平接近正常,臨床表現也恢復正常。本實驗表明免疫原在誘發EAE的同時損傷了胸腺,隨病情的發生發展胸腺萎縮,細胞凋亡增多,可能導致免疫耐受異常,加重疾病;在疾病恢復之前胸腺結構和功能先恢復,早于臨床表現及腦組織病理學改變。凋亡的胸腺細胞呈先降低后恢復的動態改變,說明胸腺具有自我恢復性,可以促使疾病緩解,胸腺可能參與EAE的發病過程,與EAE發病有明顯關系,其機制還需進一步研究。

1 Chen X,Fang L,Song SLetal.Thymic regulation ofautoimmune disease by accelerated differentiation of Foxp3+regulatory T cells through IL-7 signaling pathway[J].J Immunol,2009;183（10）:6135-6161.

2 Dong M,Liu RC,Guo Letal.Pathological findings in ratswith experimentalallergic encephalomyelitis[J].APMIS,2008;116（11）:972-984.

3 Kono D H,U rban J L,Horvath S Jetal.Two minor determ inants of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL/Jmice[J].JExp Med,1988;168:213-227.

4 Stoeckle C,Tolosa E.Antigen processing and presentation in multiple sclerosis[J].Results Probl CellDiffer,2010;51:149-172.

5 Ueno S,Kashimoto T,Susa Netal.Reduction in peripheral lymphocytes and thymus atrophy induced by organotin compounds in vivo[J].JVet Med Sci,2009;71（8）:1041-1048.

6 Duszczyszyn D A,Williams J L,Mason Hetal.Thym ic involution and proliferative T-cell responses inmultiple sclerosis[J].JNeuroimmunol,2010;221（1-2）:73-80.

7 Cavallotti D,D'Andrea V,Pastore FSetal.Pathogenesisofsome neurological immuneultrastructuralandmorphometricalobservationson rat thymus[J].Neurol Res,2005;27（1）:41-46.

8 Tsunoda I,Libbey JE,Kuang L Qetal.Massive apoptosis in lymphoid organs in animalmodels for primary and secondary progressivemultiple sclerosis[J].Am JPathol,2005;167（6）:1631-1646.

9 ZimeckiM,A rtym J,Kocieba Metal.Calf thymus extract attenuates severity of experimental encephalomyelitis in Lewis rats[J].Folia Neuropathol,2010;48（4）:246-257.

10 Song F,Guan Z,Gienapp IEetal.The thymus playsa role in oral tolerance in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,2006;177（3）:1500-1509.

11 Thümm ler K,Ramming A,Schulze-Koops Hetal.Cellular therapy in autoimmune disease[J].Z Rheumatol,2009;68（4）:337-339.

12 Anderton SM.Treg and T-effector cells in autoimmune CNS inflammation:a delicate balance,easily disturbed[J].Eur J Immunol,2010;40（12）:3321-3324.

13 Broux B,HellingsN,Venken Ketal.Haplotype 4 of themultiple sc lerosis-associated interleukin-7 receptor alpha gene influences the frequency of recent thym ic emigrants[J].Genes Immun,2010;11（4）:326-333.

14 KorporalM,Haas J,BalintBetal.Interferon beta-induced restoration of regulatory T-cell function inmultiple sclerosis ispromptedby an increase in newly generated naive regulatory T cells[J].Arch Neurol,2008;65（11）:1434-1439.

[收稿2010-08-10 修回2011-01-25]

（編輯 倪 鵬）

Study the relationship of clinical disease and the injury of thymus in EAE rat

YUANHong-Yu,DONGMei,LIURui-Chun,GUOLi,GUOYan-Su,WUDong-Xia,CHENLi-Ping.DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

Objective:To study the relationships between clinical diseaseand injury of thymus in different stageof experimental allergic encephalomyelitis（EAE）.Methods:Observing clinical nervous functional scores of different groupswer observed,aftermeasuring the body weights of rats,the thymuswere taken outandweighted it,thenweaccounted the thymus index.Weobserved the brain and thymus in lightm icroscopy to compare the changes in differentgroups.The apoptotic cells of thymusweremeasured by flow cytometry in different groups.Results:EAE ratwere paralyzed at different levelboth in the third day group and the fifth day group,the clinical scoreswere 2.60±1.22 and 1.50±0.512 respectively and they had no statistical significance.Significantatrophy and the numbers of lymphocytes of thymuswere seen in the third day group in lightmicroscopy.The lymphocytes increased in the fifth day group but theywere still lower than in the recovery group.There were increased lymphocytes and tight structure in recovery group.A lot of inflammatory cellswere seen in brain in the third day group;many perivascular cuffingswere in tissuesand they wereenclosed by inflammatory cells in fifth day group;therewereobviously diseased inflammatory cells in recovery group.Thymus indexwas lower in the third day group than in other groups（P＜0.05）and therewere no statistical significance in other threegroups.The apoptotic rateof thymus cellswas higher in the third day group than in other threegroups（P＜0.05）,there wereno statistically significant in other threegroups（P＞0.05）.Conclusion:The rat thymuses of EAEwere atrophy first and got improved.The recovery of thymuswas earlier than clinical symptomswhich showed that the thymuswere recoverable.The thymusmay participate in the course of EAE.

Experimental allergic encephalomyelitis;Clinical disease;Thymus;Apoptosis;Pathology

R744.5

A

1000-484X（2011）05-0459-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.018

①本文受河北省科技廳資助項目（No.08276101D-2）

袁宏宇（1984年-）,男,碩士,主要從事脫髓鞘疾病研究;

及指導教師:董 梅（1969年-）,女,博士,副主任醫師,主要從事脫髓鞘疾病研究。