麻風(fēng)病人T細(xì)胞亞群相關(guān)免疫分子表達(dá)的調(diào)查

趙寶泉 尹格平 （濟(jì)南市皮膚病防治院,濟(jì)南 250001）

麻風(fēng)病人T細(xì)胞亞群相關(guān)免疫分子表達(dá)的調(diào)查

趙寶泉 尹格平①（濟(jì)南市皮膚病防治院,濟(jì)南 250001）

很多疾病其外周血免疫學(xué)檢測(cè)與分析多見(jiàn)報(bào)道[1,2],相比之下,麻風(fēng)病由于患者數(shù)量有限,其外周血相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)相對(duì)較少。本研究對(duì)新發(fā)、復(fù)發(fā)48例經(jīng)我院治療的麻風(fēng)病患者,在治療前及第2、4周的外周血T淋巴細(xì)胞相關(guān)免疫分子進(jìn)行了動(dòng)態(tài)流式細(xì)胞的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)治療前后及與健康組相比均有不同變化,有一定的臨床意義,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 所有患者中男性占27例,年齡35～62歲,平均48歲;女性,21例,年齡37～ 65歲,平均年齡51歲。治療方案按衛(wèi)生部印發(fā)的《麻風(fēng)病聯(lián)合化療手冊(cè)》的規(guī)定執(zhí)行。患者主要臨床表現(xiàn)體征以及檢查結(jié)果參考如下[3]:皮損并伴有淺感覺(jué)障礙及閉汗;周?chē)窠?jīng)干或皮支神經(jīng)粗大;皮損組織切片內(nèi)查到麻桿菌;病理組織中見(jiàn)到特異性改變。健康組共計(jì)27例,年齡在30～60之間,其中男性14例,女性13例。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 流式細(xì)胞儀檢測(cè)為FACScan型,由美國(guó)BD公司生產(chǎn),CellQuestPlot軟件由BD公司提供,淋巴細(xì)胞分離液由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所出品,用于免疫陰性對(duì)照的IgG1-FITC/IgG1-PE抗體、異硫氫酸熒光素（FITC）標(biāo)記的鼠抗人CD3/CD4/CD8（三色標(biāo)記）、CD3/HLA-DR（雙色標(biāo)記）和CD3/CD16+CD56+（雙色標(biāo)記）均由美國(guó)Pharmingen產(chǎn)品,北京岳泰公司提供。

1.2.2 取樣方法 所有麻風(fēng)病患者于治療前抽取肘靜脈血2m l,選取2%的EDTA（乙二胺四己酸）1∶9抗凝;于治療后第2周及4周再抽肘靜脈血2ml,同上法抗凝,另取27例健康組的外周血作對(duì)照,取樣同上。

1.2.3 提取外周血淋巴細(xì)胞（PBL） 將2ml經(jīng)過(guò)抗凝的靜脈血放于10ml試管,加入2 ml淋巴細(xì)胞分離液,以1 500 r/min的速度離心10分鐘,提取其淋巴細(xì)胞層,再以2 ml磷酸緩沖液（PBS）漂洗,同速離心2次,棄去上清液,然后將細(xì)胞懸液分入2支5 ml試管中,調(diào)整細(xì)胞數(shù)至106m l-1,備用[4]。

1.2.4 熒光單克隆抗體免疫標(biāo)記淋巴細(xì)胞的方法于 3支試管中各加500μl PBL,加20μl相應(yīng)的單克隆抗體 CD3/CD16+CD56+、CD3/CD4/CD8和CD3/HLA-DR工作液;另一支試管加20μl陰性對(duì)照抗體 IgG1-FITC/IgG1-PE,均避光反應(yīng) 20分鐘,以2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15分鐘,磷酸緩沖液2 m l漂洗,再同速離心漂洗1次,棄去上清液,最后加入PBS 500μl待測(cè)。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法 上樣前先以標(biāo)準(zhǔn)熒光微球調(diào)整儀器的變異系數(shù)并將其穩(wěn)定在2%以內(nèi),上樣后收集2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,光散射數(shù)據(jù)存入軟盤(pán),熒光強(qiáng)度以對(duì)數(shù)形式放大,測(cè)試完后于Macintosh650計(jì)算機(jī)上用CellQuest Plot軟件分析數(shù)據(jù),最后用HP1200c/PC打印結(jié)果。

1.2.6 檢測(cè)項(xiàng)目 上樣后記數(shù)輔助和誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3+/CD4+）、輔助和誘導(dǎo)與細(xì)胞毒抑制T淋巴細(xì)胞比值（CD4/CD8）、CD3+/HLA-DR、CD3+/CD16+CD56+、NK（CD3-/CD16+CD56+）、靜止 性 T 細(xì)胞（CD3+/HLA-DR-）、活化 T淋巴細(xì)胞（CD3+/HLADR+和CD3+/CD16+CD56+）。健康組及患病組檢測(cè)值均以 ˉx±s形式表示,所得數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 健康組外周血淋巴細(xì)胞亞群CD3/CD4/CD8、CD3/HLA-DR、CD3/CD16+CD56+和 CD4/CD8比值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

本組健康組男性CD3+/CD4+變化范圍26.59%～42.26%、CD3+/CD8+變化范圍20.02%～28.98%、CD3+/CD（l6+56）+在0.75%～1.55%、CD3+/HLADR+在0.65%～1.73%、NK在1.74%～4.56%、CD3+/HLA-DR-在 47.14%～ 58.64%、CD4/CD8比值變化范圍1.23～1.84之間。女性CD3+/CD4+變化范圍27.10%～41.52%、CD3+/CD8+變化范圍20.56%～27.67%、CD3+/CD16+CD56+在0.59%～1.69%、CD3+/HLA-DR+在 0.72%～ 1.77%、NK 在2.11%～4.71%、CD3+/HLA-DR-在 47.85%～58.08%、CD4/CD8比值變化范圍1.29～1.76之間。t檢驗(yàn)證實(shí)健康組男女性各淋巴細(xì)胞亞群之間均無(wú)顯著差異（P＜0.05）。

2.2 麻風(fēng)患者外周血淋巴細(xì)胞亞群CD3/CD4/CD8、CD3/CD16+CD56+、CD3/HLA-DR 和 CD4/CD8比值測(cè)定結(jié)果,見(jiàn)表2。

統(tǒng)計(jì)學(xué)表明本組患者治療前外周血淋巴細(xì)胞亞群中 CD3+/CD4+、NK、CD3+/HLA-DR-檢測(cè)值和CD4/CD8比值均分別低于健康組相應(yīng)參數(shù),經(jīng)檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,活化T淋巴細(xì)胞CD3+/CD16+CD56+和CD3+/HLA-DR+檢測(cè)值分別高于健康組相應(yīng)參數(shù),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）,CD3+/CD8+的檢測(cè)值較健康組低,但經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。48例患者在治療后的第2周CD3+/CD4+、NK 、CD3+/HIA-DR-檢測(cè)值和CD4/CD8比值分別有所提高,CD3+/CD16+CD56+和CD3+/HLADR+稍有下降或變化不明顯;第4周時(shí)與健康組相比較上述免疫指標(biāo)已接近正常水平（P＞0.05）。

3 討論

目前,有關(guān)麻風(fēng)病患者治療過(guò)程中外周血淋巴細(xì)胞相關(guān)免疫分子動(dòng)態(tài)測(cè)定的報(bào)道較少。由于輔助和誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞CD3+/CD4+細(xì)胞是機(jī)體的重要免疫細(xì)胞,在抗病毒感染的反應(yīng)中起到了重要作用。CD3存在于成熟T淋巴細(xì)胞膜上,為該細(xì)胞的主要標(biāo)志。一般情況下,CD3+/CD4+與細(xì)胞毒抑制T淋巴細(xì)胞（CD8）之間相互影響相互制約,CD4/CD8比值的變化在限定范圍內(nèi),維持著免疫功能的穩(wěn)定,如果此比值過(guò)高,則提示免疫功能過(guò)強(qiáng),反之提示免疫功能過(guò)低。CD3/HLA-DR屬于HLAⅡ類(lèi)抗原,它主要存在于外周血B淋巴細(xì)胞、激活的T淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞上[5]。器官移植后干擾素γ（IFN-γ）、Ⅱ類(lèi)抗體原表達(dá)增加也能誘導(dǎo)Ⅱ類(lèi)抗原表達(dá)。CD3/CD16+CD56+抗原主要表達(dá)于自然殺傷細(xì)胞,該細(xì)胞群主要表達(dá) CD16、CD57和 D65,其中以CD16+CD56+活性最強(qiáng),可達(dá)90%以上,主要參與細(xì)胞毒抑制T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞反應(yīng)。

目前,聯(lián)合化療仍為麻風(fēng)病治療的首選方案,聯(lián)合化療復(fù)發(fā)率明顯低于DDS單獨(dú)治療。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)男、女性患者治療前外周血淋巴細(xì)胞亞群中NK、CD3+/CD4+、CD3+/HLA-DR-檢測(cè)值和 CD4/CD8比值均分別低于健康組相應(yīng)值,CD3+/CD8+的檢測(cè)值較健康組低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有患者在治療2周NK 、CD3+/CD4+、CD3+/HLA-DR-檢測(cè)值和CD4/CD8比值均分別有所提高,CD3+/CD（16+65）+和CD3+/HLA-DR+稍有下降或變化不明顯,CD3+/CD8+的檢測(cè)值稍有增高;第4周時(shí)上述免疫指標(biāo)已接近正常水平。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)大部分例患者治療前外周血淋巴細(xì)胞亞群及活化T淋巴細(xì)胞的檢測(cè)值異常,治療2周明顯改善,第4周上述免疫指標(biāo)已接近正常水平,為聯(lián)合化療后機(jī)體免疫功能恢復(fù)的結(jié)果,患者早期病情波動(dòng),機(jī)體免疫功能較低,晚期波動(dòng)時(shí)機(jī)體免疫功能變化不明顯,與化療時(shí)間有關(guān)。本研究證明麻風(fēng)病與機(jī)體免疫功能密切相關(guān),免疫檢測(cè)值增高提示預(yù)后較好,檢測(cè)值低則預(yù)后差。上述結(jié)果有助臨床判斷病情預(yù)后,有重要的臨床意義。

表1 健康組外周血淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果（±s）Tab.1 Assay of peripheral lymphocytes（PBL）subsets in the healthy group（±s）

表1 健康組外周血淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果（±s）Tab.1 Assay of peripheral lymphocytes（PBL）subsets in the healthy group（±s）

Sex CD4+ CD8+ CD 3+/CD（16+56）+ NK CD3+/HLA-DR-CD3+/HLA-DR+ CD4/CD8 Male 34.21±6.53 23.91±3.42 1.16±0.35 3.13±1.30 52.83±4.41 1.20±0.41 1.55±0.26 Female 33.98±5.81 24.31±3.12 1.12±0.48 3.21±1.12 53.33±4.55 1.23±0.45 1.51±0.19

表2 麻風(fēng)患者外周血淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果（±s）Tab.2 Assay of peripheral lymphocytes（PBL）subsets in lep rosy patients（±s）

表2 麻風(fēng)患者外周血淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果（±s）Tab.2 Assay of peripheral lymphocytes（PBL）subsets in lep rosy patients（±s）

Note:There was significant difference between experimental group and controlgroup.

Text time CD4+ CD8+ CD 3+/CD（16+56）+ NK CD3+/HLA-DR-CD3+/HLA-DR+ CD4/CD8 Male（n1=27）Before treatment 25.72±8.74 18.65±8.24 4.20±2.65 1.21±0.74 41.22±4.31 3.15±2.53 0.95±0.39 Twoweeksafter treatment 28.81±9.22 19.45±7.68 3.56±2.63 3.44±1.64 48.32±9.98 2.55±1.54 1.02±0.43 Fourweeksafter treatment 31.31±5.64 22.11±4.51 2.20±1.35 3.16±1.56 50.13±5.64 2.00±0.55 11.24±0.27 Female（n2=21）Before treatment 25.36±7.58 18.68±7.66 5.64±2.68 1.31±0.64 40.14±3.51 3.36±2.78 0.86±0.56 Twoweeksafter treatment 27.61±8.76 19.77±7.36 3.786±2.43 3.68±1.22 48.52±9.97 2.65±1.78 1.23±0.57 Fourweeksafter treatment 32.17±5.44 23.51±4.34 2.21±1.54 3.24±1.20 51.32±4.42 2.12±0.61 1.23±0.51

1 Jackson P A,GreenM A,Mark CGetal.Lymphocyte subsets in infiltration patterns and HLA antigen status in Colorectal carcinomas and adenomas[J].Gut,1996;38:85-89.

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4 尹格平,陳誦芬,孫曉明etal.卵巢癌組織及外周血淋巴細(xì)胞多藥基因（MDR）表達(dá)蛋白的定量研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,1998;5（33）:287-289.

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[收稿2010-12-20 修回2011-01-25]

（編輯 張曉舟）

R755

A

1000-484X（2011）05-0466-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.020

①濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院流式細(xì)胞研究室,濟(jì)南250023

趙寶泉（1960年-）,男,本科,副主任醫(yī)師,主要從事麻風(fēng)病方面的研究。

·專題綜述·