藥對桂枝?白術及其單味藥中揮發(fā)油成分GC-MS的比較分析

佘金明，鐘明，梁逸曾，彭友林，張茂美，譚斌斌

(1. 中南大學 化學化工學院，湖南 長沙，410083；2. 常德職業(yè)技術學院 藥學系，湖南 常德，415000；3. 湖南文理學院 生命科學系，湖南 常德，415000)

藥對桂枝?白術及其單味藥中揮發(fā)油成分GC-MS的比較分析

佘金明1,2，鐘明1，梁逸曾1，彭友林3，張茂美2，譚斌斌1

(1. 中南大學 化學化工學院，湖南 長沙，410083；2. 常德職業(yè)技術學院 藥學系，湖南 常德，415000；3. 湖南文理學院 生命科學系，湖南 常德，415000)

采用水蒸氣蒸餾法從桂枝、白術及其藥對中提取揮發(fā)油成分，通過氣相色譜?質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術對其進行分離檢測，結合直觀推導式演進特征投影法(HELP)對重疊色譜峰進行分辨解析；同時，利用程序升溫保留指數(shù)輔助定性。研究結果表明：從單味藥桂枝、白術及其藥對中鑒定出66，29和55個組分，分別占揮發(fā)油成分總量的94.43%，95.93%和96.35%；單味藥與藥對共有4種組分，占藥對揮發(fā)油總含量的13.14%；組成藥對后，新增4種組分，單味藥桂枝消失33種組分，白術消失7種組分；藥對中揮發(fā)油主要成分是2-(2-甲氧基)苯甲氧基苯酚、γ-芹子烯和桂皮醛等，它們主要來自于白術；藥對種類與含量變化并不是單味藥的簡單相加，其作用機理有待進一步研究。

直觀推導式演進特征投影法；藥對；桂枝-白術；揮發(fā)油；氣相色譜?質(zhì)譜

藥對專指臨床上相對固定的 2味藥所組成的方劑，是中藥復方配伍中最簡單、最基本和最常見的形式。它在臨床上產(chǎn)生作用的大小直接受配伍規(guī)律的影響；因此，分析藥對配伍前后發(fā)生的化學變化和物理作用，有利于剖析和闡明復方中藥的配伍機理，促進藥對的理論研究和臨床應用[1]。可見，加強藥對的配伍規(guī)律研究是解決中藥復方配伍理論這一核心問題的基礎和重要切入點[2]。桂枝Ramulus Cinnamomi(RC)為樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl．的干燥嫩枝，主產(chǎn)于廣東、廣西、云南等地；白術系菊科植物白術atractylodes macrocephalakoidz．(AM)的根莖，主要分布于浙江、江西、湖南、湖北等省[3?4]。二者收載于《中華人民共和國藥典》第 1部。桂枝?白術都是辛溫解表藥，且為常用脾胃相輔藥對。桂枝辛甘而溫，走表則溫經(jīng)散寒，以驅表邪，入里則溫陽散結，以暖脾胃；白術甘溫苦燥，善于補脾氣，燥化水濕，與脾喜燥惡濕之性相合，為補脾要藥，除風痹之品。桂枝配白術，既可走表，溫經(jīng)通絡，除痹止痛，又可走里，以溫中健脾化濕[5]。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，桂枝、白術還具有抗腫瘤的特殊作用[4,6]。目前，桂枝和白術單味藥中揮發(fā)油成分已有報道[7?11]，它們是臨床應用的主要活性成分來源，但該藥對中揮發(fā)油成分未見報道。本文擬采用化學計量學中的直觀推導式演進特征投影法(Heuristic evolving latent projections，HELP)[12]，對桂枝?白術中GC-MS分析的色譜峰與單味藥進行比較，得到藥對與單味藥揮發(fā)油成分的種類與含量變化，為建立它們的指紋圖譜、研究藥對的配伍規(guī)律及尋找新的活性成分提供依據(jù)。

1 理論基礎

直觀推導式演進特征投影法(HELP)由 Kvalheim等[13?14]提出，其基本原理如下。

由n種有機化合物響應信號組成的GC-MS二維數(shù)據(jù)矩陣A0，可表示為：

式中：C=[c1, c2, …, cn]，矢量ci是化合物i的純色譜；S=[s1, s2, …, sn]，矢量si是化合物i的純質(zhì)譜；T代表矩陣轉置；Ab為背景矩陣；E為隨機誤差陣。設扣除背景后的矩陣為A，式(1)可寫為：

對矩陣A進行主成分分解得：

式中：T為含n列的得分矩陣，稱為抽象色譜矩陣；P為含n列的載荷矩陣，為抽象光譜矩陣；對n階滿秩方陣R，RR?1=I，結合式(3)，有：

比較式(2)和式(4)可得：

R稱為旋轉矩陣，具有將抽象色譜轉換為真實色譜的功能。上式對應的矢量表達式為：

式(6)中ri是矩陣R中第i列。在HELP中，對于不含有包埋色譜峰的重疊體系，利用選擇性區(qū)域，零濃度區(qū)域可確定 ri，在此基礎上化合物i的純色譜 ci可由式(6)計算，其純質(zhì)譜si可以通過其選擇性區(qū)域直接求出，結合si和ci即可對化合物i進行準確的定性定量分析。

該方法充分利用了二維矩陣數(shù)據(jù)的色譜、光譜 2個方面信息，采用局部主成分分析和滿秩分辨技術得到混合物中各個組分的純色譜和光譜，從而實現(xiàn)對色譜重疊峰組分進行定性定量分析，為復雜樣品分析給出了一條新途徑，已成功應用于中藥現(xiàn)代化研究[15?17]。

2 實驗部分

2.1 儀器、藥材與試劑

儀器為：GC-MS-6890-5973型氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫科技有限公司生產(chǎn))，標準玻璃揮發(fā)油提取器(上海滿賢經(jīng)貿(mào)有限公司生產(chǎn))。

藥材為：廣東產(chǎn)桂枝、湖北產(chǎn)白術(長沙九芝堂藥材公司)，樟科植物肉桂的干燥嫩枝和菊科植物白術干燥根莖的土炒品。

試劑為：無水硫酸鈉和正己烷，均為分析純；正構烷標準溶液 C8～C20和 C21～C40(美國 Sigma公司生產(chǎn))。

2.2 揮發(fā)油提取與供試液配制

2.2.1 藥對揮發(fā)油提取

將桂枝、白術樣品粉碎成粒徑為250 μm粉狀，分別取60 g和40 g(臨床用藥要求)藥粉混合裝入1 L的圓底燒瓶中，加水500 mL振搖混合后浸泡2 h，按《中國藥典》(2005版)一部附錄“揮發(fā)油提取法”甲法進行，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，然后，進行水蒸氣蒸餾，并保持微沸約4 h，至測定器中油量不再增加時停止加熱。按規(guī)定操作，用移液管或吸管取出揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，測得其揮發(fā)油產(chǎn)率為0.85%。該揮發(fā)油為具有香味的黃色透明油狀液體。

2.2.2 單味藥揮發(fā)油的提取

分別稱取上述粉碎過篩后的桂枝、白術各100 g，按上述方法提取，分別得到質(zhì)量分數(shù)為 0.53%的淡黃色特殊香郁油狀物和1.15%的金黃色黏稠揮發(fā)油。

2.2.3 供試液配制

從藥對藥揮發(fā)油中取100 μL，用正己烷定容至3 mL，然后用針筒式微孔濾膜過濾，低溫貯存，供進樣用。再用同樣的方法對單味藥揮發(fā)油進行前處理。

2.3 GC-MS分析條件

色譜條件：采用程序升溫，從 50 ℃開始維持 2 min，以 12 ℃/min 升溫速度升至 130 ℃，再以 4 ℃/min升至240 ℃維持2 min，最后以10 ℃/min升至260 ℃并維持 2 min結束；HP-5MS彈性石英毛細管柱 30 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣為He氣(99.999%)；載氣流速為1.0 mL/min；進樣口溫度為280 ℃；分流比為 50：1；進樣量為 1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度為230 ℃；接口溫度為280 ℃；電子能量為70 eV。

3 結果與討論

3.1 揮發(fā)油成分的定性分析

圖1所示為上述實驗條件下，桂枝、白術及其藥對揮發(fā)油成分的GC-MS總離子流圖(TIC)。通過質(zhì)譜工作站檢索，可以初步確定上述物質(zhì)中各色譜峰的特征。以圖1(a)中的峰簇P(保留時間段為13.632～ 13.790 min)為例，將其放大(見圖2(a))，得到1個不規(guī)則的齒峰，在不同位置呈現(xiàn)出較大的質(zhì)譜變化，從而可以進一步確定它是一組重疊峰。直接檢索其定性結果與相似度從左至右依次為：γ-himachalene(91%)，γ-Muurolene(66%)，Copaene(89%)，α-Curcumene(83%)和(+)-cycloisosativeene(85%)。該結果表明它們的可信度較低，不利于進行定量分析。但是，通過HELP對重疊峰進行解析后，得到它們的純色譜圖(見圖 2(b))和質(zhì)譜圖。這是一個質(zhì)譜特征明顯、相似度很高的 3組分，通過與NISI-05庫檢索，分別得到γ-Muurolene(98%)，α-Curcumene(94%)和 α-Muurolene (97%)。

圖1 桂枝、白術和藥對桂枝?白術揮發(fā)油的總離子流圖Fig.1 TICs of essential oil from Ramulus Cinnamomi (RC)(a),atractylodes macrocephala (AM)(b) and herbal pair HP RC-AM(c)

用相同的方法對桂枝、白術和桂枝-白術的TIC圖進行解析，并結合程序升溫保留指數(shù)及相關資料，分別鑒定出66，29和55個組分，占系統(tǒng)自動檢識峰數(shù)量的91.67%，87.9%和93.22%。

3.2 揮發(fā)油成分的定量分析

對解析后的所有純色譜的峰面積進行積分，得到單味藥與藥對揮發(fā)油中各化學成分的定量分析結果，見表1。

圖2 圖1(a)中峰簇P的TIC圖及應用HELP解析后的色譜圖Fig.2 TICs of P peak cluster in Fig.1(a) and resolved chromatograms of P peak cluster with HELP

表1 桂枝(RC)、白術(AM)和桂枝-白術(RC-AM)樣品揮發(fā)油中主要化學成分分析結果Table 1 Result of main chemical compositions analysis for essential oils from RC, AM and RC-AM samples

3.3 單味藥與藥對中揮發(fā)油成分比較

中藥在合煎過程中存在水解、氧化?還原、脫羧、聚合與異構化反應等，且同時伴有助溶作用；因此，藥對中其種類與含量變化并不等于2種單味藥的簡單相加。如單味藥桂枝組成藥對后的變化，一是由于桂枝中含量低于0.50%的成分達32種，只占其揮發(fā)油的 6.43%，它們在蒸餾過程中易被散失，組成藥對后，消失了21種組分；二是發(fā)生化學變化，生成了新物質(zhì)，如桂枝中的桂皮醛組成藥對后其含量由23.78%下降至4.90%。另外，該藥對中異構化現(xiàn)象比較明顯，如藥對中的主要成分γ-芹子烯，如果它是單味藥加和，則它在藥對中的含量應該是6.00%～7.00%，而實際是20.06%。從物質(zhì)的結構和含量變化來看，一部分來自于白術中的芹子烯，另一部分可能是從存在于桂枝與白術中芹子烯的異構體轉化而來。

由于藥材產(chǎn)地與提取方法不同，導致藥材主要揮發(fā)油成分的種類與含量也存在較大差異。單味藥桂枝與白術不同種屬，因此，它們的共有成分較少；桂枝中含量最高的是桂皮醛，與文獻[7]中的結果一致，而文獻[8]報道的揮發(fā)油主要成分是芳樟醇(14.85%)和二十七烷(10.96%)、順式細辛醚(7.54%)等；白術中含量最高的是2-(2-甲氧基)苯甲氧基苯酚，這與文獻[9?10]中結果一樣，而與文獻[11]中報道的蒼術酮含量不一致。

4 結論

(1) 從桂枝、白術及其藥對中鑒定出66，29和55個組分，分別占其揮發(fā)油總量的 94.43%，95.93%和96.35%；單味藥與藥對共同含有4種揮發(fā)油成分，分別是丁子香烯、甘香烯、雅檻藍樹油烯和β-馬阿里烯，占藥對揮發(fā)油總量的13.14%，而它們在單味藥中的對應量分別為 3.69%和 7.20%；組成藥對后，單味藥桂枝消失 33種組分，白術消失 7種組分。藥對新增 4種組分，其成分依次為3-利膽醇、2-丁酰基呋喃、橙花醇乙酸酯和醋酸金合歡醇酯。

(2) 桂枝中主要含有桂皮醛、cis-細辛醚、O-甲氧基桂皮醛、γ-杜松烯等；白術以2-(2-甲氧基)苯甲氧基苯酚、γ-芹子烯等為主要成分；而藥對中揮發(fā)油成分主要是2-(2-甲氧基)苯甲氧基苯酚、γ-芹子烯、大根香葉烯B、雅檻藍樹油烯、桂皮醛等，它們主要來自于單味藥白術。

(3) 通過 HELP解析重疊色譜峰后進行定性定量分析，將會極大地減少誤檢、漏檢，從而提高分析的可靠性與準確度。該方法與 GC-MS技術已成為研究藥對中揮發(fā)油成分種類、含量變化及其機理的有力工具。

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(編輯 張曾榮)

Comparative analysis of volatile constituents in herbal pairRamulus Cinnamomi-Atractylodes macrocephalaand its signal herb by GC-MS

SHE Jin-ming1,2, ZHONG ming1, LIANG Yi-zeng1, PENG You-lin3, ZHANG Mao-mei2, TAN Bin-bin1

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China;2. Department of Pharmacy, Changde Vocational and Technical College, Changde 415000, China;3. Science of Life Department, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

The volatile constituents were extracted fromRamulus Cinnamomi(RC),Atractylodes macrocephala(AM) and herbal pair(HP) RC-AM by steam distillation. Using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) combined with heuristic evolving latent projections(HELP), a useful chemometric resolution method which can be used to resolve overlapping peaks in chromatogram, was employed to identify and comparatively analyze the volatile constituents,together with the temperature-programmed retention index for assistant identification. The results show that there are 66,29 and 55 kinds of constituents of the essential oils being identified respectively from single herb RC, AM and HP-RC-AM, and the relative amount accounts for 94.43%, 95.93% and 96.35 % of the total relative contents in order.There are 4 common volatile constitutions in single herb and HP, and accounting for 13.14% total contents in HP. There are 4 components increasing in HP, while there are 33 and 7 components losing in the single herb CR and AM respectively. The volatile principally components in HP are 2-(2-Methoxyphenoxy)phenol, γ-Selinene and Cinnamaldehyde, et al., and they are mainly from single herb AM. Their relative kinds and amount in HP are not equal to the two single herbs, whose reaction mechanism in HP should be studied further.

heuristic evolving latent projections; herbal pair;Ramulus Cinnamomi-Atractylodes macrocephala; volatile oil; gas chromatography-mass spectrometry

O657

A

1672?7207(2011)01?0022?06

2009?12?30；

2010?04?06

國家自然科學基金資助項目(20875104)

梁逸曾(1950?)，男，湖南長沙人，教授，博士生導師，從事分析化學和中藥化學研究；電話：0731-88830824；E-mail: yizeng_liang@263.net