胃癌ZAC基因的雜合性缺失檢測

張建勛，朱運(yùn)良

(鄭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)教研室，鄭州 450001)

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）是人類基因組DNA中廣泛存在的一類具有高度多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性的遺傳標(biāo)記[1].作為第二代遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于精細(xì)遺傳圖譜的構(gòu)建、抑癌基因的雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）[2]分析和法醫(yī)學(xué)中的個體識別以及親權(quán)鑒定等多個方面.

本實驗利用了已公布的DNA序列信息，首先在6q24區(qū)域查找到了位于ZAC基因兩側(cè)的4個STR遺傳標(biāo)記，然后用這4個遺傳標(biāo)記對胃癌組織進(jìn)行LOH分析.研究在胃癌中ZAC基因是否發(fā)生了雜合性缺失，并且尋找發(fā)生缺失的斷裂點(diǎn)的大致位置，為進(jìn)一步研究LOH的機(jī)理及與胃癌的關(guān)系打下基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 試驗樣本

采用河南省腫瘤醫(yī)院診斷為胃癌的30例病例為研究對象，取胃癌組織和相對應(yīng)的正常組織各30例.

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取

用有機(jī)酚-氯仿法分別提取胃癌組織和正常組織的DNA，并用紫外分光光度計檢測其純度，-20℃保存.

1.2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記的選擇

從GenBank上下載6q24區(qū)域的DNA序列，用Tandem Repeats Finder在線軟件[3]在這段DNA序列上查找到4個STR基因座，使其分布在ZAC基因兩側(cè).在線軟件（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）[4]設(shè)計引物，引物經(jīng)過GenBank的BLAST程序檢驗其特異性.引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成.4個STR基因座的引物序列、片段長度及位置見表1.

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系總體積20ul，包括1ng模板DNA，10×Buffer（含Mg2+1.5mmol/L）2μL，10mmol/L dNTPs 0.4μL，100μ mol/L的正反向引物各0.1μL，Taq DNA聚合酶1IU，體積不足部分雙蒸水補(bǔ)足.擴(kuò)增條件采用touch-down反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2min；94℃35s，62℃45s，72℃40s，每一循環(huán)退火溫度降低0.5℃，共12個循環(huán).然后94℃35s，55℃45s，72℃40s，20個循環(huán).最后72℃5min，12℃保存.

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及電泳分型

采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，用銀染法顯示電泳條帶.

表1 PCR引物序列、片段長度及物理距離

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果判斷

若某一基因座擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染后只有一條條帶，則被視為純合子；若腫瘤的某一等位基因條帶與正常樣本相比，出現(xiàn)等位基因條帶的增多或大小改變，視為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）.出現(xiàn)這兩種情況的樣本均被視為無信息性的樣本,不進(jìn)行LOH分析.

若某一基因座出現(xiàn)兩條大小不同的等位基因條帶，定義為雜合子，被認(rèn)為是具有信息的樣本，可用于LOH分析.與正常組織相比較，若腫瘤中某一STR基因座的一條等位基因條帶消失或相對密度減少50%以上記為LOH.發(fā)生LOH的樣本的STR基因座重復(fù)實驗兩次，兩次結(jié)果一致者被最終判為LOH，發(fā)生LOH的樣本數(shù)與有信息的樣本數(shù)的比值為LOH頻率.

2.2 胃癌ZAC基因雜合性缺失的檢測結(jié)果

2.2.1 各STR標(biāo)記的檢出率

所選的6q24區(qū)域上位于ZAC基因兩側(cè)的4個STR標(biāo)記均有不同程度LOH的發(fā)生，其中D6SZ2的缺失率最高，占15.0%.其次為D6SZ1（11.1%），D6SZ3（9.09%），D6SZ4（6.25%）.4個STR標(biāo)記的LOH缺失頻率見表2.

2.2.2 各樣本的檢出率

30例胃癌樣本共檢測到了3例發(fā)生了LOH，總檢測率為10%，這3例樣本的LOH圖譜見表3.第4和25號樣本在D6SZ1，D6SZ2和D6SZ3這三個連續(xù)的STR標(biāo)記中都發(fā)生了LOH，D6SZ2和D6SZ3在ZAC基因兩側(cè)，說明在4號和25號這兩個樣本中發(fā)生了包含ZAC基因在內(nèi)的4285651bp的缺失，且在本實驗中沒有找到兩端的斷裂點(diǎn).第28號樣本在D6SZ2和D6SZ4處發(fā)生了LOH，而D6SZ3處為無信息樣本.3個樣本的LOH見圖1.

表2 30例胃癌6q24上4個STR基因座的LOH頻率

表3 雜合性缺失（LOH）圖譜

圖1 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果（T：腫瘤組織，N：正常組織）

3 討論

ZAC基因定位于人類6號染色體6q24區(qū)域[5]，具有調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的功能，是一候選抑癌基因.在許多腫瘤細(xì)胞中，常檢測到基因表達(dá)產(chǎn)物下調(diào)或缺失，這可能與ZAC基因的LOH、啟動子的甲基化和組蛋白的修飾等表觀遺傳學(xué)變化有關(guān)[6].

抑癌基因通常通過二次打擊機(jī)制而失活，即一個等位基因發(fā)生了突變，另一個等位基因發(fā)生了雜合性缺失.雜合性缺失是在大部分實體瘤的基因組中發(fā)現(xiàn)的一種普遍的遺傳學(xué)改變.非隨機(jī)區(qū)域的雜合性缺失可能意味著在此區(qū)域存在有抑癌基因，它的缺失能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，因此它或許有癌變發(fā)生、發(fā)展的預(yù)后征兆的意義.

本實驗選取了位于ZAC基因兩側(cè)的4個STR標(biāo)記對胃癌標(biāo)本做LOH分析，檢測了胃癌中的ZAC基因發(fā)生了LOH的頻率，實驗結(jié)果表明ZAC基因在胃癌中發(fā)生LOH的頻率很低，僅為10%，4個STR基因座LOH的檢出率也非常低，最高的15.0%，最低的為6.25%.在已發(fā)生LOH的3個樣本中，都是發(fā)生了大片段的缺失，如第4和第25號個體的缺失片段達(dá)到4285651bp.本實驗證實了在胃癌ZAC基因中發(fā)生了低頻率的LOH，綜合其他文獻(xiàn)報道的在其他腫瘤中，ZAC基因經(jīng)常發(fā)生啟動子的甲基化和組蛋白的修飾等表觀遺傳學(xué)的改變[6].這提示在胃癌中ZAC基因的LOH和表觀遺傳學(xué)的改變都有可能引起ZAC基因的表達(dá)下調(diào)或缺失，從而導(dǎo)致了胃癌的發(fā)生.

為了進(jìn)一步研究LOH與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，我們需要進(jìn)一步研究LOH的機(jī)理，找到發(fā)生LOH的斷裂點(diǎn)，并通過不斷增加STR的密度來精細(xì)定位斷裂點(diǎn)的位置，以至于精細(xì)到某幾個堿基的位置，并比較發(fā)生LOH的這些個體中，它們的斷裂點(diǎn)處的堿基序列是否有共同的特征.

[1]任峰玲，郭雄，史曉薇，等.陜西省漢族人群11號染色體10個STR基因座的遺傳多態(tài)性研究[J].遺傳，2007，29（12）：1455-1458.

[2]Starostik P,Greiner A,Schultz A,etal.Genetic aberrations common in gastric high-grade large B-cell lymphoma[J].Blood,2000, 95(4):1180-1187.

[3]Benson G.Tandem repeats finder:a program toanalyze DNA sequence[J].Nucleic AcidsRes,1999,27(2)：573-80.

[4]Steve Rozen,Helen Skaletsky.Primer3 on theWWW for generalusers and for biologist programmers[J].Methods Mol Biol,2000,132: 365-386.

[5]Varrault A,Ciani E,Apiou F,etal.hzac encodes a Zinc finger protein with antiproliferative properties andmaps to a chromosomal region frequently lost in cancer[J].Proc Natl Acad SciUSA,1998,95(6):8835-8840.

[6]Elizabeth M Valleley,Sarah FCordery,David T Bonthron.Tissue-specific imprinting of the ZAC/PLAGL1 tumor suppressor gene results from variable utilization ofmonoallelic and biallelic promoters[J].Human MolecularGenetics,2007,16(8):972-981.