差異蛋白質組學及其在植物鹽脅迫響應研究中的應用

馬 進，劉志高，鄭 鋼

（浙江農林大學 園林學院，浙江 臨安 311300）

鹽脅迫是影響植物生長，降低作物產量的重要因素。溫室效應引起全球氣候變暖，部分地區環境惡化引起土地沙漠化和鹽堿化，預計到2050年全球將會有超過50%的耕地被鹽堿化[1]。探索植物耐鹽機制，提高植物耐鹽性，開展耐鹽作物分子育種成為一種有效的應對措施。隨著擬南芥Arabidopsis thaliana，水稻Oryza sativa，楊樹Populus trichocarpa和葡萄Vitis vinifera等植物全基因組序列測定的完成和基因組學研究的深入，植物蛋白質組學研究已成為后基因組時代的熱點之一[2]。差異蛋白質組學是蛋白質組學研究的一種重要研究策略，著重于篩選和鑒定不同種類或狀態下各樣本之間蛋白質組的區別與變化，具有很強的可實現性。植物耐鹽性是一個復雜調控網絡，不僅表現在基因轉錄水平上，更會體現在蛋白質組水平變化上，由于鹽堿化自然災害是未來農林業面臨的重大難題，筆者討論了差異蛋白質組學研究方法及植物鹽響應脅迫蛋白質組研究情況，有助于理解植物耐鹽分子機制，對我們以后進一步通過分子育種手段來提高植物的耐鹽性具有重要的意義。

1 差異蛋白質組學

1.1 差異蛋白質組學的產生背景

蛋白質是生物體生命過程中三大結構與功能分子之一，是執行生命過程各種活動的主要分子，生命中的許多過程都是由蛋白質來實現和完成的。蛋白質組學是了解基因型和表現型之間相關關系等復雜生物學問題的有效策略[3－4]，可以深入地揭示生命現象的本質，從蛋白質的相互作用關系與功能上回答生命過程的規律[5]。蛋白質組與基因組相比，對蛋白質的識別和鑒定的原則要復雜得多。隨著對蛋白質組學的深入理解和具體工作的開展，人們逐漸認識到在短時間內建立人類蛋白質組學 “完整的”數據庫和實現網絡資源共享是難以實現的或者說條件尚未成熟。于是蛋白質組學研究著重于尋找和篩選任何因素引起的若干樣本之間的差異蛋白質的表達，這樣差異蛋白質組學應運而生。

1.2 差異蛋白質組學研究技術

建立可靠的蛋白質表達水平差異分析技術十分重要，是蛋白質組分析的一個核心技術問題。差異蛋白質組學的迅速發展主要得力于大規模高通量分離和分析技術的突破性發展。

1.2.1 基于凝膠的差異分析技術 凝膠雙向電泳技術（2DE）原理是將蛋白質混合物分別經第一向等電聚焦和第二向十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），根據等電點和分子量不同將各種蛋白質在聚丙烯酰胺膠上分離開，樣品制備是凝膠雙向電泳技術的核心技術。目前，常用的制備低復雜度樣品的手段有去除高豐度蛋白、從蛋白復合物樣品中富集目的蛋白、分離細胞器蛋白和選擇合適pH值范圍的IPG（固相pH梯度）膠條等[6－7]。2DE技術是目前所有分離技術中分辨率最高，信息量最多的技術[8－9]，但對低豐度和疏水性蛋白質的檢測有先天不足等缺陷[10－11]，而這些蛋白質往往在生物學功能中發揮著重要的作用。該技術仍然有待改善。雙向差異凝膠電泳（2D-DIGE）被廣泛應用于植物定量蛋白質組學研究。這種方法將待比較樣品分別用不同熒光試劑（cy2，cy3或cy5）標記，等量混合后進行雙向電泳分離。由于熒光染料靈敏度高，故所需樣品量非常少。而且，一張膠可同時分析3個樣品，省去了不同膠圖之間的匹配問題，減少了工作量，不僅重復性顯著提高，而且提高了分析通量[12]。該技術已經被應用于受臭氧脅迫的歐洲山楊Populu stremula葉片蛋白質組[13]、擬南芥突變體油菜素內酯（BR）相關調節蛋白[14]，以及蒺藜苜蓿Medicago truncatula多根瘤突變體、野生型根響應生長素和苜蓿根瘤菌的蛋白質組研究中[15]。

1.2.2 基于非凝膠的差異分析技術 多維液相色譜（MDLC）技術解決了2DE的很多難以解決的問題，但目前尚無法完全替代2DE，但能彌補2DE的一些缺陷，如蛋白質在分離中的丟失、上樣量的限制、較窄的分離范圍等，對高、低豐度蛋白質均能進行有效分離而且自動化程度較高，因此，它是對2DE技術的有益補充[16]。體外標記技術主要包括同位素親和標簽（ICAT）和同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術。ICAT技術是利用一種新的化學試劑——同位素親和標簽試劑，預先選擇性地標記某一類蛋白質，經分離純化后，再用質譜鑒定，這種技術能夠直接鑒定和測量低豐度蛋白質。iTRAQ技術則是利用4種（最近已發展為8種）胺活性試劑組成的一組非多聚體的等質量標記試劑，對蛋白質酶解的肽段進行差異標記，再將標記的樣本混合，然后采用多維蛋白質鑒定技術（MudPIT）進行分析鑒定。Patterson等[17]利用iTRAQ技術比較了抗硼和非抗硼大麥Hordeum vulgare的蛋白質組，發現抗硼大麥含鐵細胞中的離子缺乏敏感蛋白和甲基硫代核糖激酶的表達量明顯升高。15N體內代謝標記法采用含有15N（或14N）作為唯一氮源的培養基來培養植物組織（植株），依靠摻入合成蛋白質的15N實現定量。該技術已經應用于鎘脅迫的差異表達質膜蛋白質組分析中[18]。MudPIT是從待研究樣品中提取蛋白質，將它們酶解成肽段混合物，直接上樣至多維液相色譜中進行分離，然后進入串聯質譜進行解析。與普通的2-DE方法獨立互補，代表了當前最豐富的蛋白質分離鑒定技術[19－20]。

2 差異蛋白質組學方法在植物鹽響應脅迫應用

2.1 差異蛋白質組學方法在草本植物鹽響應脅迫應用

Ramani等[21]在水稻幼苗中檢測到35個受鹽脅迫誘導的和17個受其抑制的多肽。Kav等[22]研究了鹽脅迫下豌豆Pisum sativum根器官蛋白質的變化。鹽脅迫設置2種，一種以正常生長2周的豌豆幼苗用75 mmol·L－1或 150 mmol·L－1氯化鈉溶液澆灌 6 周；另一種是種子在 75 mmol·L－1或 150 mmol·L－1氯化鈉溶液中發芽并生長1周。利用雙向電泳結合電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜（ESI-Q-TOF MS/MS）分析，在2種脅迫條件下共鑒定了35個受鹽脅迫調節的蛋白質點。Abbasi等[22]研究了水稻葉鞘在鹽脅迫下的蛋白質反應，發現54個蛋白表現出對鹽脅迫的上調和下調，8個蛋白表現出顯著的可重復的豐度變化。研究還發現7種蛋白在50 mmol·L－1氯化鈉處理24 h之后表達量達到最大，而在處理48 h之后開始下降。Yan等[23]用150 mmol·L－1氯化鈉在24，48，72 h內處理3周苗齡的水稻幼苗，然后提取水稻根總蛋白，再用2DE分離根總蛋白，檢測到1100多個蛋白點，其中包括34個上調蛋白和20個下調蛋白。Parker等[24]分析處理時間長短不同的水稻葉片蛋白質組發現在大約檢測到2500個的蛋白中有32個在鹽脅迫下發生明顯變化。對其中11個蛋白進行鑒定，發現包括1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）活化酶和鐵蛋白在內的8個蛋白在24 h 50 mmol·L－1氯化鈉處理下表達量增加，并且在其后的6 d時間內維持這種增強表達，只有一種被推測為磷酸甘油酸激酶的蛋白在24 h鹽脅迫下表達增加但在其后的時間內沒有增加，也有一些蛋白在24 h處理的時候沒有表現豐度變化，但在處理7 d以后逐漸表現增強或減弱。Kong-ngern等[25]用Western blot分析了3個水稻栽培品種，抗鹽品種 ‘Pokkali’，中度耐鹽品種 ‘Leuang Anan’和鹽敏感品種 ‘KDML 105’幼苗的3 kD蛋白，結果表現出不同的表達特性。與對照相比，抗鹽的 ‘Pokkali’和 ‘Leuang Anan’葉鞘中31 kD被鹽逆境強烈誘導。與此相反，在鹽敏感品種 ‘KDML 105’中則保持不變。而且 ‘Leaung Anan’中31 kD蛋白的表達要高于 ‘Pokkali’。這些結果說明，31 kD蛋白是水稻葉鞘中的一個鹽誘導蛋白。

Ndimba等[26]用2DE電泳方法分離了擬南芥懸浮培養物的總蛋白，共檢測到2949個蛋白點。其中266個蛋白在鹽和滲透脅迫條件下表達豐度發生變化。用激光解吸電離飛行時間質譜（LDI-TOF MS）技術鑒定了75個響應鹽和滲透脅迫的蛋白。這些蛋白分成10個功能類型，包括轉運質子三磷酸腺苷（ATP）酶、信號轉導相關蛋白、轉錄和翻譯相關蛋白、解毒酶、氨基酸和嘌呤合成相關酶、蛋白降解酶、熱休克蛋白、碳水化合物代謝有關蛋白和生物功能未知蛋白。Lee等[27]應用2DE結合蛋白質免疫印跡技術全面研究鹽脅迫過程中擬南芥發生的信號事件來分析鹽脅迫誘導的根細胞微體蛋白質組表達變化，發現鈣離子（Ca2+）依賴膜結合蛋白和定向膜聯蛋白（designated annexins）是信號中的主要組分。Chinnusamy等[28]的研究表明對鹽脅迫下擬南芥的感知導致了細胞內的鈣信號激活鈣感受蛋白SOS3，SOS3又結合并激活ser/thr蛋白激酶SOS2，活化的蛋白激酶SOS2又調節了蛋白激酶SOS1（質膜Na+/H+反向協同運輸體）和NHX1（液泡膜Na+/H+反向協同運輸體）的活性，維持了細胞內離子的平衡。研究還發現滲透型組氨酸激酶（AtHK1-MAPK）可能參與了調節滲透的動態平衡和活性氧。

Majoul等[29]在耐鹽小麥Triticum sestivum品種的幼苗中鑒定了1個26 kD受鹽脅迫影響的多肽。霍晨敏等[30]首次采用雙向電泳的方法分析10 g·kg－1氯化鈉脅迫72 h的1對小麥耐鹽（RH8706249）及敏鹽突變體（H8706234）的蛋白質組，發現了5種葉綠體蛋白可能在鹽脅迫下對葉綠體及整個細胞的功能起到重要作用。Dani等[31]用煙草Nicotiana tabacum作為模型考察了鹽脅迫下可溶性蛋白的變化，其中積累增強的包括已知的受生物和非生物逆境脅迫誘導的蛋白，特別是2個幾丁質酶和1個類發芽素蛋白顯著增加，2個脂類轉移蛋白則完全是體外表達。楊春雪等[32]以星星草Puccinellia tenuiflora為實驗材料，對碳酸氫鈉與氯化鈉脅迫下星星草根蛋白質的雙向電泳圖譜進行了初步的比較與分析，表明大部分蛋白質點在凝膠上的相對位置和豐度變化不明顯，有7個蛋白質點與氯化鈉脅迫相比為碳酸氫鈉脅迫特異誘導表達蛋白，5個點在2種鹽脅迫下豐度均上調，但在碳酸氫鈉脅迫下上調更明顯。這些蛋白參與基因表達調控及能量代謝等過程。

2.2 差異蛋白質組學方法在木本植物鹽響應脅迫應用

紅海欖Rhizophora stylosa是一種典型的紅樹林鹽生植物。范吉星等[33]研究利用差異蛋白組學技術對淡栽（R0）和30 g·kg－1氯化鈉鹽栽（R3）處理后的紅海欖根部總蛋白進行了比較研究。結果表明：在鹽水栽培上調的蛋白質一般與逆境脅迫有關，淡水栽培上調的蛋白質一般與基本代謝有關。這些研究結果為進一步研究紅海欖的耐鹽機制提供了有意義的線索。在高鹽脅迫下葡萄芽尖中191種蛋白質表達豐度發生變化，其中約44%為具有同工型的蛋白質，且參與光合作用、蛋白質合成和定位的蛋白質的表達豐度明顯下調[1]。

3 小結

差異蛋白質組學主要通過尋找、篩選和鑒定由某些因素引起的樣本之間的差異蛋白質譜，獲得對某些關鍵蛋白的定性和功能分析，從分子水平上解析更多的生命現象本質，差異蛋白質組學近年來正從定性向精確定量的方向發展。依靠差異蛋白質組學研究植物鹽響應下蛋白質組的區別與變化，取得了一些新的進展，拓展了對于植物耐鹽分子機制的認識，但仍不能令人滿意，同其他生物（動物和微生物）蛋白組學研究相比，還處于相對落后狀態。植物響應鹽脅迫代謝途徑中的離子運輸、信號轉導和能量轉換等關鍵事件的分子機制仍不清楚。該研究領域目前仍存在以下突出問題：①仍然過多地依賴于2DE-MS技術，而第2代蛋白質組學技術應用較少。②研究對象仍主要集中在擬南芥、煙草、水稻、小麥等幾個有限的物種。③膜整合蛋白和表達豐度很低的逆境相關蛋白質得不到有效分離。④差異表達蛋白質表達豐度進行分析時，缺乏嚴格和多樣化的統計學分析。⑤盡管許多植物種已有一定數目的表達序列標簽（EST），有些甚至建立了一定規模的EST庫，但是還不能滿足蛋白組質譜鑒定的要求。

隨著蛋白質組學的研究技術方法的不斷創新與發展，差異蛋白質組學和基因組學技術相結合，從基因組、蛋白質組水平研究基因表達和蛋白質表達特性，分離篩選耐鹽脅迫下特異表達的基因群和蛋白質，分析特定基因群的轉錄至翻譯與耐鹽性之間的相關性，從分子水平系統詮釋植物耐鹽分子機制成為可能。

[1]VINCENT D，ERGUL A，BOHLMAN M C，et al.Proteomic analysis reveals differences between Vitis vinifera L.‘Chardonnay’ and ‘Cabernet Sauvignon’ and their responses to water deficit and salinity [J].J Exp Bot，2007，58：1873－1892.

[2]JAILLON O，AURY J M，NOEL B，et al.The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla [J].Nature，2007，449：463 － 467.

[3]ZIVY M，DE VIENNE D.Proteomics：a link between genomics，genetics and physiology[J].Plant Mol Biol，2000，44：75－80

[4]CANOVAS F M，DUMAS-GAUDOT E，RECORBET G，et al.Plant nroteome analysis [J].Proteomics，2004，4：285－298.

[5]ROSSIGNOL M，PELTIER J B，MOCK H P，et al.Plant proteome analysis：a 2004-2006 update [J].Proteomics，2006，6：5529－5548.

[6]GRANGER J，SIDDIQUI J，COPELAND S，et al.Albumin depletion of human plasma also removes low abundance proteins including the cytokines[J].Proteomics，2005，5 （18）：4713 － 4718.

[7]FOSTER L J，CARMEN L H ，ZHANG Y L，et al.A mammalian organelle map by protein correlation profiling [J].Cell，2006，125：187－199.

[8]李蕾，應萬濤，楊何義，等.蛋白質組研究中的二維電泳分離技術[J].色譜，2003，21（1）：27－31.LI Lei，YING Wantao，YANG Heyi，et al.Two-dimensional electrophoresis separation technique in proteome research[J].Chin J Chromatogr，2003，21 （1）：27 － 31.

[9]張群業，陳竺.差異表達蛋白質組學中的常用技術[J].國外醫學遺傳學分冊，2004，27（2）：64－71.ZHANG Qunzhu.Usual technology in differential proteomics [J].Forg Med Sci，2004，27 （2）：64 － 71.

[10]CORDWELL S J，NOUWENS A S，VERRILLS N M，et al.Subproteomics based upon protein cellular location and relative solubilities in conjunction with composite two-dimensional electrophoresis gels [J].Electrophoresis，2000，21：1094－ 1103.

[11]LEN A C，CORDWELL S J，HARTY D W，et al.Cellular and extracellular proteome analysis of streptococcus mutans grown in a chemostat[J].Proteomics，2003，3：627 － 646.

[12]LILLEY K S，FRIEDMAN D B.All about DIGF：quantification technonogy for differential dispay 2D-gel proteomics[J].Expert Rev Proteomics，2004，1 （4）：401 － 409.

[13]BOHLER S，BAGARD M，OUFIR M，et al.ADIGE analysis of developing poplar leaves subjected to ozone reveals major changes in carbon metabolism [J].Proteomics，2007，7：1584 － 1599.

[14]DENG Z，ZHANG X，TANG W，et al.A proteomics study of brass inosteroid response in Arabidopsis [J].Mol CellProteomics，2007，6：2058－ 2071.

[15]VAN NOORDEN G E，KERIM T，GOFFARD N，et al.Overlap of proteome changes in Medicago truncatula in response to auxin and Sinorhizobium melioti[J].Plant Physiol，2007，144：1115 － 1131.

[16]ROMIJN E P，KRIJGSVELD J，HECK A J.Recent liquid chromato-graphic-（tandem） mass spectrometric applications in proteomics [J].J Chromatogr A，2003，1000 （1－2）：589－608.

[17]PATTERSON J，FORD K，CASSIN A，et al.Increased abundance of proteins involved in phytosiderophore production in boron-tolerant barley [J].Plant Physiol，2007，144：1612 － 1631.

[18]LANQUAR V，KUHN L，LELIEVRE F，et al.15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells [J].Proteomics，2007，7：750 － 754.

[19]MAOR R，JONES A，THOMAS S，et al.Multidimensional protein identi-fication technology （MudPIT） analysis of ubiquitinated proteins in plants [J].Mol Cell Proteomics，2007，6：601 － 610

[20]FLORENS L，VASHBURN M P.Proteomic analysis by multidimensional protein identification technology [J].Meth Mol Biol，2006，328：159 － 175.

[21]RAMANI S，APTE S K.Transient expression of multiple genes in salinity-stressed young seedling of rice（Oryza sativa L.） ‘Bura Rata’ [J].Biochem Biophys Res Commun，1997，233：663 － 667

[22]ABBASI F M，KOMASTU S.A proteomic approach to analyze salt-responsive proteins in rice leaf sheath [J].Proteomics，2004，4：2072－2081.

[23]YAN Shunping，TANG Zhangcheng，SU Weiai，et al.Proteomic analysis of salt stress-responsive proteins in rice root[J].Proteomics，2005，5 （1）：235 － 244.

[24]PARKER R，FLOWERS T J，MOORE A L，et al.An accurate and reproducible method for proteome profiling of the effects of salt stress in the rice leaf lamina [J].J Exper Bot，2006，57：1109 － 1118

[25]KONG-NGERN K，DADUANG S，WONGKHAM C，et al.Protein profiles in response to salt stress in leaf sheaths of rice seedlings [J].Sci Asia，2005，31：403 － 408.

[26]NDIMBA B K，CHIVASA S，SIMON W J，et al.Identification of Arabidopsissalt and osmotic stress responsive proteins using two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry[J].Proteomics，2005，16：4185 －4196.

[27]LEE S，LEE E J，YANG E J，et al.Proteomic identification of annexins，calcium-dependent membrane binding proteins that mediate osmotic stress and abscisic acid signal transduction in Arabidopsis [J].Plant Cell，2004，16：1378－1391.

[28]CHINNUSAMY V，JAGENDORF A，ZHU J K.Understanding and improving salt tolerance in plants[J].Crop Sci，2005，45：437－448.

[29]MAJOUL T，CHAHED K，ZAMITI E，et al.Analysis by two-di-mensional electrophoresis of the effect of saltstress on the polypeptide patterns in roots of a salt-tolerant and a salt-sensitive cultivar of wheat [J].Electrophoresis，2000，21：2562－2565.

[30]霍晨敏，趙寶存，葛榮朝，等.小麥耐鹽突變體鹽脅迫下的蛋白質組分析[J].遺傳學報，2004，31（12）：1408－1414.HUO Chenmin，ZHAO Baocun，GE Rongchao.Proteomic analysis of the salt tolerance mutant of wheat under salt stress [J].Acta Genet Sin，2004，31 （12）：1408 － 1414.

[31]DANI V，SIMON W J，DURANTI M，et al.Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress[J].Proteomics，2005，5：737 － 745.

[32]楊春雪，羅秋香，卓麗環，等.NaHCO3脅迫下星星草根特異表達蛋白初步鑒定[J].分子植物育種，2008，6（4）：669－674.YANG Chunxue，LUO Qiuxiang，ZHUO Lihuan，et al.Preliminary identification of root specific-expressed protein in Puccinellia tenuiflora under NaHCO3stress [J].Mol Plant Breed，2008，6 （4）：669 － 674.

[33]范吉星，鄧用川，黃惜，等.紅海欖根部鹽脅迫反應的比較蛋白質組學分析[J].中國生物化學與分子生物學報，2009，25 （1）：72 － 77.FAN Jixing，DENG Yongchuan，HUANG Xi，et al.Comparative proteomic analysis of salt-stress response proteins in Rhizophora stylosan roots [J].Chin J Biochem Mol Biol，2009，25 （1）：72 － 77.