蛋白質組學在胰腺癌早期診斷中的應用

蘇安平 田伯樂

·綜述與講座·

蛋白質組學在胰腺癌早期診斷中的應用

蘇安平 田伯樂

蛋白質組學的提出及其相關技術的發展為胰腺癌的早期診斷奠定了基礎。其直接定位于蛋白質水平，從整體、動態、定量的角度研究基因功能，有助于發現用于早期臨床診斷的腫瘤標志物，同時也可應用于尋找新的治療靶標和進一步揭示胰腺癌發生、發展機制。本文就近年來蛋白質組學在胰腺癌早期診斷中的應用做一概述。

一、蛋白質組學及其相關技術

蛋白質組(proteome)的概念源于蛋白質與基因組兩個詞的雜合，指一個細胞、組織或有機體所表達的全部蛋白質。蛋白質組學(proteomics)則以蛋白質組為研究對象，研究整個基因組在不同時間、空間編碼的全部蛋白質的組成及其相互作用[1]。具體包括三個方面[2]：(1)蛋白質的大規模鑒定和翻譯后修飾的微特征研究；(2)差異表達蛋白質組學，即對多種疾病有廣泛應用前景的蛋白質表達水平的比較；(3)應用質譜技術和酵母雙雜交體系研究各種蛋白質間的相互作用。其中差異表達蛋白質組學在胰腺癌早期診斷中應用廣泛。

蛋白質組學研究成功與否很大程度上取決于其技術水平的高低。蛋白質組學研究主要包括三大技術：(1)蛋白質組分的分離技術；(2)蛋白質組分的鑒定技術；(3)利用蛋白質信息學進行蛋白質結構和功能的預測技術。

1．蛋白質組分的分離技術：目前，最常用的分離技術是雙向凝膠電泳(2-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技術[3-6]。2-DE技術主要用于分離細胞或組織蛋白質抽提物，構建特定細胞或組織蛋白質的二維電泳圖譜，分析特定條件下蛋白質的表達水平，進行差異蛋白質組學分析。由于具有高分辨率、高重復性、微量分析和制備等優點，現已成為蛋白質組學研究中首選的分離技術[3]。除2-DE技術外，用于蛋白質組分分離的技術還有親和層析、毛細管區帶電泳、反向高效液相色譜和多維色譜等[4]。

2．蛋白質組分的鑒定技術：目前常用的鑒定技術是質譜(mass spectrometry,MS)鑒定技術。根據生物大分子離子化的方式不同，MS鑒定技術可以分為：基質輔助激光解吸離子化-飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和電噴霧離子化質譜(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)。前者應用激光使生物大分子離子化，得到酶解肽段的分子量，fingerprint,從而獲得蛋白質的肽質量指紋圖譜(peptide massPMF)，然后應用適當的軟件搜尋蛋白質組數據庫，實現對蛋白質的定性鑒定。后者則通過噴射過程中的電場進行離子化，可以進行肽的測序，得出肽段的氨基酸序列，從而獲得肽序列標簽(peptide sequence tag, PST)[5]。根據部分氨基酸序列，結合此段氨基酸序列前后的離子質量和肽段母離子的質量，在蛋白質數據庫中查尋，鑒定出相應蛋白質。MS鑒定技術還可應用于蛋白質翻譯后修飾以及蛋白質相互作用等研究領域。除MALDI-TOF-MS、ESI-MS外，許多新技術也開始應用于蛋白質的鑒定及相互作用的研究，如生物傳感芯片質譜(biosensor chip mass spectrometry)[6]、蛋白質芯片(protein chip)[7]、表面增強激光解吸離子化-飛行時間質譜(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)[8]、同位素標記親和標簽(isotope coded-affinity tags，ICAT)技術[9]等。

3．蛋白質組分的生物信息學：生物信息學(bioinformatics)就是利用計算機科學和網絡技術來解決生物學問題。在蛋白質組學方面，蛋白質組學技術所得到的高通量的研究結果需要強大的數據處理工具支持，因此生物信息學是蛋白質組學研究中不可缺少的一部分。生物信息學可對其研究的內容進行數據分析、儲存、管理、搜集和修復等處理。生物信息學在蛋白質組學研究中有兩個重要應用：(1)分析和構建雙向凝膠電泳圖譜；(2)搜索與構建蛋白質組數據庫。目前常用的數據庫有PSD、SWISS-PROT、PROSITE、PDB等[7,10-11]。

二、蛋白質組學在胰腺癌早期診斷中的應用

目前，已有學者應用蛋白質組學技術從胰腺癌患者血漿、胰液和癌組織中尋找相關腫瘤標志物，為胰腺癌的早期診斷提供理論支持。

1．胰腺癌血漿蛋白質組學研究：由于血漿獲取方便且成本低廉，是蛋白質組學在胰腺癌早期診斷研究中的理想樣本。但是由于血漿蛋白的復雜性，蛋白質組學研究非常困難。Valerio等[12]使用MALDI-TOF-MS技術未能從胰腺癌患者血漿中鑒定出胰腺癌腫瘤特異性標志物。近年來，隨著SELDI-TOF-MS等新技術的發展，血漿蛋白質組學的研究邁入一個新階段。Honda等[13]應用表面增強激光解吸電離合并混合型四極時間飛行質譜對245例血清樣本進行分析，發現了4個蛋白質峰：m/z 8766、m/z 17272、m/z 28080和m/z 14779，四者聯合診斷的敏感性為97.2%，特異性為94.4%，若結合CA19-9，診斷符合率達100%。Koopmann等[14]利用SELDI-TOF-MS技術分析胰腺癌患者和正常人的血漿，鑒定出3種蛋白質：PC-A、PC-B和CA19-9。這3種蛋白質作為腫瘤特異性標志物應用于臨床檢測時，PC-A蛋白敏感性為83%，特異性為85%；PC-B蛋白敏感性為70%，特異性為85%；CA19-9蛋白敏感性為64%，特異性為85%。國內學者付文廣等[15]采用SELDI-TOF-MS技術分析了23例胰腺癌、25例正常人和11例其他胰腺疾病(慢性胰腺炎7例、胰腺假性囊腫4例)血清標本，發現血清蛋白質指紋圖譜中有44個差異表達的蛋白質，其中m/z 2732 敏感性為91.30%，特異性為68.18%；m/z 9111 敏感性為52.17%，特異性為81.82%。

2．胰腺癌胰液蛋白質組學研究：由于90%的胰腺癌為導管細胞腺癌，因此通過ERCP獲取的胰液標本也富集由胰腺導管細胞所釋放的癌特異性蛋白[16]，這讓胰液檢測成為胰腺癌早期診斷的重要手段。Rosty等[17]利用SELDI-TOF-MS技術分析來自胰腺癌和其他胰腺疾病患者的胰液，發現了一個蛋白質峰并鑒定為肝癌-小腸-胰腺/胰腺炎相關蛋白I(hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancretitis-associated protein I,HIP/PAP-I)，其在胰腺癌胰液中的濃度顯著高于其他胰腺疾病。繼而采用ELISA檢測，證實HIP/PAP-I與胰腺癌密切相關，提示檢測胰液中的HIP/PAP-I可能有助于胰腺癌的早期診斷。Gronborg等[18]利用2-DE和LC-MS/MS技術對3例胰腺癌患者的胰液進行分析，分別鑒定出73、61、115個蛋白質。其中，23個蛋白質同時存在于3例胰腺癌患者胰液中，并鑒定出一個新的蛋白質，因其結構與HIP/PAP-I類似，將其命名為PAP-2，這一蛋白質可能成為胰腺癌早期診斷的腫瘤標志物。Chen等[19]利用ICAT和LC-MS/MS技術分析胰腺癌患者和胰腺炎患者的胰液，鑒定出3種差異表達蛋白質：纖維蛋白原B鏈、血漿纖維蛋白溶解酶/血漿纖維蛋白溶解酶原、神經細胞黏附分子L1。同時，Chen等[16]還用定量蛋白質組的方法比較了胰腺癌患者和正常健康人胰液蛋白譜的差異。發現有30個差異蛋白質點均出現>2.0倍的表達差異。隨后應用Western blotting對胰島素樣生長因子結合蛋白2進行進一步驗證，結果表明其在胰腺癌患者的胰液和組織中表達均增高。

3．胰腺癌組織蛋白質組學研究：在胰腺癌蛋白質組研究中最常用的方法是直接檢測癌組織和正常對照組織。在癌組織樣本中，候選腫瘤標志物可能具有較高濃度，并且有利于MS鑒定。癌組織篩選出來的差異表達蛋白質，還可進一步發展為血漿標志物。Lu等[20]利用2-DE和MALDI-TOF-MS技術對12例胰腺癌患者癌組織和癌旁組織進行分析，成功鑒定出111種差異表達蛋白質。其中，70種蛋白質在癌組織中有較強表達(多數>2.0倍)，而在正常組織中只有41種較強表達。在70種較強表達蛋白質中，兩種蛋白質(fascin和cathepsin D)通過免疫組化得到證實。最重要的是fascin在21例胰腺癌患者癌組織中13例陽性表達，而在正常胰腺組織中無一表達，且fascin的表達與胰腺癌的分化程度密切相關。Shen[21]等聯合應用2-DE和MALDI-TOF-MS技術比較分析了6例胰腺癌組織、2例癌旁組織、7例胰腺炎組織和6例正常胰腺組織之間蛋白質表達譜的差異，鑒定出40種差異表達蛋白質。其中7種調節蛋白質經Western blotting和免疫組化得到確認，包括：a-烯醇酶(a-enolase)、組織蛋白酶D(cathepsin D)、鈣網織蛋白(calreticulin)、galectin-1、銅鋅超氧化物岐化酶(CuZnSOD)和錳超氧化物岐化酶(MnSOD)?；?0%～90%胰腺導管細胞腺癌細胞散布于成纖維細胞間質中，Shekouh等[22]利用激光捕獲顯微切割(1aser-capture microdissection)技術分別切取4例胰腺癌患者癌組織、2例胰腺癌患者配對癌旁組織及2例正常人胰腺組織的導管上皮細胞，并進行2-DE分離及MALDI-TOF-MS分析，結果發現9種蛋白質差異表達。其中5種在癌細胞中表達增加，4種表達減少。并鑒定出4種差異表達蛋白質：S100A6、膜連蛋白III、乳酸脫氫酶和胰蛋白酶。其中，S100A6在胰腺癌組織中特異性的高表達得到了免疫組化染色的證實，同時研究表明S100A6與胰腺癌的分期密切相關。

三、蛋白質組學的問題及應用前景

蛋白質組學已經成為生命科學領域的研究熱點之一，并已形成臨床蛋白質組學分支。在蛋白質組學研究策略普遍被接受的同時，也應該清醒地認識到蛋白質組學技術現階段還不是一種完美的工具，在當前技術條件的限制下，還有一些問題等待解決。例如如何解決不同的研究方法、研究對象(血漿、胰液和組織)、研究人數對實驗結果的影響；如何解決高豐度蛋白對低豐度蛋白的掩蓋；如何提高實驗數據的重復性[23]。要解決上述問題，對胰腺癌蛋白質組學的研究應考慮以下幾方面：(1)是否有足夠的研究人數；(2)是否根據WHO的標準對胰腺癌進行組織學分類，是否對非腫瘤組織樣本進行組織學描述；(3)是否根據年齡、性別和相關疾病選擇對照組；(4)如何識別蛋白峰；(5)是否通過ELISA、Western blotting或免疫組化對差異表達蛋白質進行鑒定驗證。盡管目前存在許多困難，但是隨著技術與方法的不斷創新與發展，蛋白質組學必將在胰腺癌的早期診斷中發揮越來越重要的作用。

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2010-04-12)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.027

610041 四川成都，四川大學華西醫院肝膽胰外科

田伯樂，Email：bo-le@medmail.com.cn