疾病體外檢測和診斷技術的新發展

唐時幸，康可人，李銀太

·述評·

疾病體外檢測和診斷技術的新發展

唐時幸，康可人，李銀太

從全球范圍來看，疾病體外檢測、診斷試劑的需求在不斷增長，年增長率達到 5.5％；我國診斷試劑的市場增長率達到近 20％[1]。特異、敏感和快速的疾病體外檢測和診斷方法是預防和治療疾病的重要手段和前提。一些新的檢測技術和平臺正逐漸應用于疾病的檢測和診斷，引起了越來越多的關注。隨著納米技術（nanotechnology）和材料的興起與蓬勃發展，依賴納米材料和技術的新的疾病診斷方法的研究正在成為疾病檢測和診斷的熱點；基于納米材料和技術的新的疾病診斷方法可能成為新一代疾病體外檢測和診斷方法而受到世界各國的廣泛重視。其他像芯片技術（microarray chip）、微流控技術（microfluidic device）和生物傳感器（biosensor）等也開始應用于疾病的體外檢測，這些新技術相互結合為新的疾病檢測方法研發提供了更多的選擇。

1 納米材料與技術

一般講，納米技術指的是基于原子和分子水平的研究而導致的在納米標尺（1 ～ 100 nm）的結構和系統的發展和實際應用[2]。更重要的是這些納米標尺的結構和系統因為其獨特的大小而擁有了新的性質和功能。納米材料所擁有的獨特的性質和功能使它們能被用來解決一些我們以前的技術所無法解決的問題，這就是這項新技術的生命力所在。比如不同大小的納米顆粒顯現的不同顏色的熒光信號，使之非常方便用于多指標的同時檢測。Agrawal 等[3]采用兩種不同大小的量子顆粒（quantum dots）標記抗呼吸道融合病毒（RSV）抗體，用于同時檢測病毒表面的不同蛋白，只需單個激發光源，就能同時獲得兩種不同的熒光信號，根據這兩種信號強度的差異，就可以區分變異病毒株，或者是判斷病毒表面病毒蛋白分子數量，是一種非常簡單、快速、敏感的多指標檢測方法[3]。納米顆粒在一定條件下發生聚集而導致納米溶液顏色的改變，這一變化可以直接用于樣本中生物標志物的檢測[4]。比如納米金顆粒標記上特異性抗體或寡核苷酸鏈后，分散狀態的納米金顆粒溶液呈現淡紅色。在特異的抗原或核酸存在時，納米金顆粒借助抗原抗體或核酸鏈雜交結合在一起，聚集的納米金顆粒溶液也因此由淡紅色轉變為紫色或黑色，借助納米溶液的顏色變化，就能判斷樣本中特定的生物標志物。此外，納米顆粒標記上核酸后可明顯提高核酸雜交的溫度，因而提高核酸檢測的特異性等。納米科技與生物科學、醫藥學的結合，正迅速成為新的熱點和前沿領域。納米醫學將推動基因治療、分子靶向治療研究和疾病診斷的快速發展。在疾病檢測和診斷方面，納米材料和技術的應用在提高檢測方法和診斷的敏感性和特異性方面展現了很好的前景。目前研究的重點在：

⑴納米材料的合成和修飾。早在 20 世紀 70年代末期納米金顆粒就被用于組織學免疫染色，當時稱為膠體金（gold colloid），主要是利用抗原、抗體同納米金顆粒的物理吸附將它們標記在金顆粒表面，用于相應的免疫組織化學檢測。由于對這類材料研究不多，膠體金的應用范圍非常有限。到 20世紀 90 年代末期，納米技術和納米材料被列為美國國家發展戰略計劃后，對這類新材料和技術的重視迅速升溫，納米材料的合成與修飾、標準化分析、對環境和人體健康的影響等研究迅速發展成為一門專門的學科，多種多樣的納米材料被研發出來，大大促進了納米技術的發展和應用。比如把有機的熒光分子加入到納米顆粒中，每個納米顆粒可包含上萬個熒光分子，這樣可以大大提高熒光信號的強度，因而提高檢測的敏感性。此外，在納米顆粒內部，熒光分子被疏水分子層隔離，增加了熒光分子的穩定性，減少了高濃度熒光分子產生的“漂白”現象[5]。再比如借助納米顆粒相對較大的表面積，在其表面標記少量的抗體和數十個，乃至上百個寡核苷酸鏈，借助抗原抗體的特異結合來檢測特異抗原，通過測定納米顆粒表面的寡核苷酸鏈來實現信號的放大，因而提高檢測的敏感性[6-7]。Tang 等[6]在 20 nm 金顆粒表面標記上抗 HIV p24 抗體和隨機寡核苷酸鏈用于檢測 p24 抗原，每一個金顆粒表面可以結合約 70 個核苷酸分子。這樣理論上每一個抗原抗體分子結合反應，將有 70 個核酸分子被釋放出來，因此蛋白信號也放大了至少 70 倍。同樣也可以在合成脂質體（liposome）納米顆粒時，把寡核苷酸鏈包括在納米顆粒中心，最后檢測時把結合在抗原抗體復合物上納米顆粒溶解，釋放出其中的寡核苷酸鏈，通過檢測釋放的核酸鏈用于信號的放大檢測[8]。尤其是用 PCR 方法進一步放大所釋放的核酸鏈，檢測的敏感性將進一步提高。其他像在納米顆粒表面添加適當的化學基團，通過化學反應來實現抗原-抗體的共價結合，提高標記的特異性和穩定性等，可以進一步提高基于納米材料的檢測試劑產品的穩定性和改善質量控制。

納米材料指的是直徑在 1 ～ 100 nm 的新材料，從形狀和結構區分包括納米顆粒（nanoparticle）、納米管（nanotube）和納米膜（nanofilm）；從來源看包括合成的納米顆粒、偶遇的納米顆粒和自然存在的納米物質（像病毒顆粒和病毒蛋白形成的納米級顆粒等）。納米碳管的直徑 ＜ 100 nm，但其長度可以達到微米級，整個表面積遠遠大于單個納米顆粒，更適合標記許多大的蛋白分子。比如 Wang 等[9]在 1 μm 長的納米碳管上標記 9600 個辣根過氧化物酶，用于免疫學檢測，檢測 IgG 的濃度可達到 500 fg/ml，其敏感性就遠遠大于常規的酶聯免疫學檢測。一些自然存在的蛋白納米顆粒，比如乙型肝炎病毒表面抗原形成的丹式顆粒，更容易消化、分解，對環境的影響和破壞會更小，應該給予更多的關注。納米材料的物理、化學和生物學性質和功能都不同于大分子材料，一些利用納米材料的檢測方法，其敏感性和特異性較傳統方法有很大的提高，被越來越多地應用，與納米材料獨特的理化性質密不可分。新的納米材料的發現、合成、應用，是推動以納米材料為基礎的新檢測方法研發的重要環節，也是納米材料科學研究的重要內容，有很多基礎理論問題需要解決，需要化學、高分子材料、物理學、生物學等多學科的相互配合。當然，納米材料的毒性和對環境的影響，也越來越受到關注，期待深入研究闡明。

⑵納米材料與傳統檢測方法的結合。現代疾病檢測方法經歷了生化、酶化學、免疫學、核酸分子雜交和核酸基因體外擴增及序列分析等幾個階段，相應建立了許多檢測平臺，如膠體金快速檢測試紙、酶聯免疫方法和多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）等，這些原有的檢測平臺與新的納米材料結合，大大改善了原有方法的敏感性和特異性，而成為新的檢測平臺和系統。比如在2007 年我們研發的利用納米金顆粒和銀染色檢測艾滋病病毒核衣殼蛋白的方法，是在原免疫學檢測方法基礎上改進的，用納米金顆粒取代傳統辣根過氧化物酶催化底物顯色，改進后的方法檢測敏感性是原方法的 100 ～ 150 倍，能提前 3 ～ 4 天檢測出艾滋病病毒感染[6]。在2009 年，我們又用銪熒光納米顆粒（europium nanoparticle）取代納米金顆粒，因為一個銪納米顆粒含有 3 萬個熒光分子，能產生很強的熒光信號，改進后的方法檢測敏感性比傳統的酶聯免疫方法提高 100 倍[5, 10]。Mason 等[8]把納米顆粒與 PCR 方法結合檢測霍亂毒素 β 亞單位，解決了蛋白質無法在體外擴增的難題，通過 PCR 擴增納米顆粒中攜帶的寡核苷酸鏈分子，實現對待檢測毒素分子的間接放大，可以檢測到0.02 fg/ml（相當于 10 個分子）。

⑶納米材料同新檢測技術的結合。納米材料也被大量用于一些新的檢測方法和平臺，像基因芯片技術、生物傳感器和微流控裝置等。在 2010 年我們發展了一種全基因的基因芯片檢測技術，該方法是直接將待檢測的核酸加到基因芯片上進行雜交，借助標記在納米金顆粒表面的核酸探針與待檢測的核酸分子雜交，再通過銀顯影液還原在納米金顆粒表面形成銀殼來“顯色”，其敏感性可以接近 PCR水平[11]。由于待檢測的核酸不需經過 PCR 放大，檢測所需時間大大縮短，也不用擔心 PCR 方法中常見的“污染”問題。我們在檢測流感病毒時發現，如果待檢測樣品中的核酸量足夠大的話，雜交后形成的銀殼很大，結果可以直接用肉眼判讀或是借助簡單的儀器判斷，不需要貴重的儀器設備。如果增加銀“染色”次數或是選擇用還原金顆粒在原來的金顆粒表面再形成一層金殼，因為還原后的金殼比銀殼更大，檢測的敏感性也因此更高。最后，納米金顆粒可以提高核算雜交的溫度，因此可以提高檢測方法的特異性，減少假陽性，可以用于單個堿基突變的基因診斷。目前我們用該技術檢測流感病毒、西尼羅河病毒和 AIDS 病毒，可以檢測到1000 個病毒顆粒，比傳統的基因芯片雜交方法簡單、快速[11]。Chin 等[12]將金顆粒加銀染色方法與微流控技術結合建立了快速檢測HIV和梅毒的移動微流控芯片（mobile microfluidic chip，mChip）方法，只需要 1 μl 全血，該方法已經在非洲現場應用，檢測 HIV 和梅毒的敏感性分別為 100％ （95％ 的可信限范圍為 98.6％ ～ 100％）和 95％ （85.4％ ～ 100％），特異性分別為 100％（99.2％ ～100％）和 81％（64.2％ ～ 97.7％）。

近十年來基因芯片技術（microarray technology）被越來越多地用于疾病診斷，其最大的優點是可以同時檢測多個疾病指標。但目前核酸檢測的基因芯片技術基本上是 PCR 和核酸雜交方法的結合，是先用 PCR 方法對待檢測的核酸加以放大，再通過核酸雜交方法來確定樣本中存在何種疾病的核酸。因此它仍然沒有克服 PCR 和核酸雜交技術的一些缺點。相反，基因芯片技術本身比較復雜，目前很難常規開展。此外，傳統的蛋白質芯片技術用蛋白（抗原或抗體）來檢測疾病標志，問題是沒能在體外對蛋白標志物進行放大，檢測信號較弱，因而沒能提高檢測的敏感性。納米顆粒用于標記和芯片檢測，可以明顯改善檢測的敏感性和特異性。這些新技術和材料的結合應用，將促進芯片技術在疾病檢測的應用。

生物傳感器（biosensor）是一類特殊的傳感器，它以生物活性單元（如酶、抗體、核酸、細胞等）作為生物敏感單元，將生物反應或是理化反應過程轉變成容易獲取和識別的光、電信號的分析裝置。最常用的生物傳感器就是血糖檢測儀，其利用葡萄糖氧化酶催化血糖降解，產生的電子被電極捕獲而感知血糖及其濃度。實際上，血糖檢測試紙也是最簡單和最常見的微流控裝置。生物傳感器也大量應用納米材料于檢測中，像利用表面等離子共振技術（surface plasmon resonance，SPR）檢測表面生物物質的方法，在結合納米顆粒或是對表面進行適當處理后，SPR 信號差異就明顯加大，相應的檢測平臺就更加實用。生物傳感器非常適合用于疾病快速檢測和診斷，因此是快速檢測試劑（point-of-care，POCT）平臺常用的技術。

2 微流控裝置

微流控是研究在微米甚至納米級微小環境中液體流動的原理、精確控制和應用。微流控裝置（microfluidic device）就是由若干微細管道（其中至少一個管道的直徑小于 1 mm）組成的網絡樣結構，液體的流動受若干控制閥門的控制。簡單說就是一張芯片上的實驗室（lab-on-a-chip），能夠把需要在實驗室完成的多步反應放在由很多管道組成的若干個分區的玻片（或其他材質）上完成[13]。因為樣本和液體在狹窄的管道中流動和混合，分子間接觸和碰撞加快，反應可以快速完成，縮短了檢測時間。此外，狹小的反應空間決定了相對小的反應體積，所需的樣本量和試劑等相應減少，一是可以減少對樣本的需求，便于檢測一些很難獲取的樣本；二是可以減少試劑用量，降低成本。微流控裝置的最大特點是容易實現自動化檢測，減少對實驗室和檢測人員的依賴，只需將待檢測樣品加入檢測孔，整個檢測過程就能自動完成，檢測結果的穩定性和可靠性也因此得到保障。從 20 世紀 80 年代開始，微流控技術主要用于噴墨打印機，現在被廣泛用于制備基因芯片、臨床檢測的微流控裝置等。應當看到微流控技術是未來疾病檢測方法的一個很有潛力的平臺，微流控技術正是一個冉冉升起的新興產業，到 2013 年其市場價值可達到 10 億 ～30 億美元[14-15]。幾項新的進展如下：

⑴探索采用新的、廉價材料，如采用紙作為支撐物，研發適用于基層、資源貧乏地區以及快速檢測試劑（POCT）。比如美國西雅圖大學 Yager 博士實驗室近年來研發的二維紙網絡（2 dimentional paper-based networking，2-DPN）檢測系統，在原來的 POCT 檢測試紙基礎上進行改進，增加了洗脫和增強染色等步驟，進一步提高了檢測的敏感性[16-17]。哈佛大學 Whitesides 博士的實驗室研發的硝酸纖維素膜微流控系統，用于血糖等的檢測，能匹配現有的血糖檢測儀，敏感性達到 4 mg/ml[18-19]。建立在硝酸纖維素膜上的芯片檢測方法，利用毛細管層析原理，進行芯片檢測，對傳統芯片系統是巨大的改變，在多指標檢測中展現了很好的應用前景。

⑵核酸快速檢測系統。簡單的微流控系統用于蛋白和小分子檢測，已經有很多的報道。近年來用于核酸的快速檢測，把樣本處理、核酸提取、擴增和檢測放在同一個微流控裝置中實現，并同傳統的利用納米金顆粒顯色的快速檢測系統結合，實現核酸的快速檢測。英國劍橋大學 Lee 博士實驗室報道，采用同溫核酸放大和金顆粒標記加免疫層析分析快速檢測方法建立了一種簡單放大方法（simple amplification-based assay, SAMBA），可以在現場快速檢測、肉眼觀察結果，能檢測到 500 拷貝/ml 的HIV-1 核酸，只比傳統的 PCR 方法差 10 倍左右[20]。納米材料與微流控技術結合的核酸快速檢測方法因其簡單、快速，相應的核苷酸鏈易于合成，特別適合快速建立新的檢測方法，為公共衛生突發事件中病原體的快速檢測和鑒定，食品安全方面新出現的病原體等的快速檢測等提供了新的技術平臺，應該受到更多重視。

⑶新檢測系統，如阻抗檢測、非標記系統等。物理學和電化學檢測方法應用于疾病檢測平臺，建立了很多新的簡單的檢測系統。比如非標記檢測(label free detection)，就是在檢測裝置的表面包被上特異性抗原或抗體，結合樣本中相應的抗體或抗原，導致結合表面阻抗或者是光偏振的改變，借助相應的物理學信號反映樣本中待檢測標志物的存在和量。非標記檢測的優勢是不需要標記，使檢測方法研發更加簡單、快速；減少了對生物原材料的需求，將原來的雙抗體（或抗原）夾心法轉變成簡單單一抗原抗體反應。將微流控平臺中的化學發光或電化學信號，轉變為數字信號，相應出現了所謂的數字免疫學方法（digital immunoassay），是微流控技術的一個發展。比如日本東京大學的 Iino 等[21]報告結合有單個生物標志物的納米顆粒，在一個疏水的微孔陣芯片借助水油相的不混合性分離，每個孔中的信號經過CMOS影像感應器轉變成數字信號，可以直接記錄免疫反應液中的單個生物標志物，檢測敏感度可達到 78 zM。

⑷新用途，如基因序列分析、分子檢測等。斯坦福大學 Quake 博士實驗室發明的微流控數字PCR 方法（microfluidic digital PCR）在基因組序列分析方面比新一代核酸序列分析儀（454，Solexa，SOLiD）有更多的優勢，不需要對待檢測的分子進行克隆篩選，可以對測序文庫直接定量，誤差小于10％[22]。

新技術和材料的發展和應用是推動疾病檢測方法發展的動力，也是新一代疾病檢測方法發展的方向。這些新技術應用的結果是進一步改善了檢測方法的敏感性和特異性，使檢測儀器進一步小型化、自動化，能更好滿足快速檢測和研發適合資源缺乏、條件有限地區使用的檢測試劑和儀器。此外，這些新技術的相互結合、整合，也是今后疾病檢測方法發展的趨勢和方向。

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