電刺激小腦頂核對缺氧缺血新生大鼠學習記憶能力的影響

陶德雙, 張麗華, 譚麗萍, 楊本利, 李曉紅, 王立蘋, 孫穎

缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy,H IE)患兒大約有15%～25%死亡,幸存兒中因智力障礙、腦性癱瘓或癲癇而存留永久性神經心理障礙的比例高達25%[1]。其中學習記憶障礙嚴重影響患兒的生活質量。腦缺血是導致認知障礙的重要原因,缺血性腦損傷誘導基因表達,其中多種基因編碼的蛋白質產物直接或間接參與了學習記憶過程的調控,信號轉導與轉錄激活子3(signal transducer and activator of transerip tion l,STAT3)是近年來新發現的一條細胞因子信號轉導途徑[2]。該途徑廣泛參與細胞的增殖、分化、凋亡、調節等過程。STA T3在急性腦缺血損傷中有間接的促凋亡作用。電刺激小腦頂核可通過神經源性保護作用而減輕腦損傷和促進腦功能恢復,作為外源性的干預因素促進內源性神經干細胞的活化和增殖,目前主要用于成人腦損傷的治療而關于缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain dam age,H IBD)方面報道較少。本研究擬通過動物實驗探索電刺激小腦頂核對腦損傷鼠空間學習記憶功能恢復及對STAT3的影響,研究其可能的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 7日齡普通級W istar大鼠(動物合格證號:黑動字第99102001)36只,體質量12～17 g,雌雄不限,由佳木斯大學動物實驗中心提供。按隨機數字表法分為電刺激組、模型組、假手術組各12只。

1.2 試劑與設備 SP免疫組織化學試劑盒、STAT3單抗(北京博奧森生物工程有限公司);小腦頂核電刺激儀(北京仁和公司);Y-型電迷宮(張家港市生物醫學儀器廠);自制常壓缺氧箱30 cm×40 cm×50 cm,二端分別有直徑約1 cm的進、出氣口。

1.3 動物模型制備 新生大鼠H IBD模型的制備與小腦頂核刺激參照經典 Rice法將新生7日齡Wistar大鼠置于含乙醚氣體的密閉容器內,吸入麻醉至停止運動后30 s左右取出。仰臥位固定在操作臺上,氣管正中胸骨上窩偏左上0.5 cm處切1 cm左右的縱切口,分離肌肉、血管、神經,結扎左頸總動脈。手術結束后放回籠內恢復2 h左右。之后將動物放入8%氧氣和92%氮氣混合氣體的低氧艙中,測氧儀監測氧濃度在8.0%±0.1%,持續2 h。結束后放回籠內。假手術組只切開大鼠頸部皮膚并暴露左頸總動脈不結扎,縫合皮膚后不入缺氧艙,母乳常規喂養。

1.4 實驗方法 手術第2 d電刺激組即開始電刺激治療。電刺激儀刺激仔鼠兩側小腦頂核(相當于兩側耳后乳突部),選用強度60 mA,頻率136 Hz,每次20 min,每日2次。假手術組和模型組不予電刺激,相應時段僅予抓捉固定。

1.5 觀察指標

1.5.1 Y-型迷宮檢測 電刺激后,應用Y-型迷宮按照固定次數(20)對大鼠進行學習記憶檢測。將大鼠放入迷宮中,隨機地將起步區以外的任一臂信號燈打開,使之成為條件信號,經5 s的延時后給不亮燈的兩臂及連接區開始通電使之成為非安全區,刺激動物從起步區跑向安全區,當大鼠受電刺激逃到安全區后燈光繼續亮30 s,而大鼠逃至安全區燈光繼續亮的30 s即為兩次測試間的休息時間,熄燈后馬上開始第二次測試,大鼠所在支臂就作為下一次測試的起步區,依次重復固定測試20次,以連續20次測試中有18次正確反應為達到學會的標準,記錄每一動物迷路分辨學習達到標準前所需要的總時間和主動回避率、正確反應率。

1.5.2 病理觀察 各例石蠟包埋組織均取厚5μm切片三張做STAT3免疫組織化學染色,一張用磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對照,采用SP法進行抗STAT3免疫組織化學染色。

1.5.3 圖像分析 采用OLYMPUS多功能顯微鏡自動成像系統及攝像裝置采圖,每張切片分別于腦皮質和海馬區隨機選取5個高倍(400倍)視野;應用Image-p ro p lus 6.0圖像分析系統對免疫組織化學中神經細胞的STAT3蛋白進行積分光密度(IOD)的測定和分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析,實驗全部結束后,整理資料,實驗數據以x±s表示。多組均數比較用單因素方差分析,組間兩兩比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Y-迷宮測試 見表1,2。

表1 刺激7日齡大鼠學習記憶能力的比較( x±s,n=6)

表2 刺激 14日齡大鼠學習記憶能力的比較( x±s),n=6

由表 1,2可見,電刺激 7、14日齡大鼠 Y-迷宮測試,模型組、假手術組總時間較電刺激組增長(P<0.05),電刺激組與假手術組相比增長(P<0.05)。模型組主動回避反應率和正確反應率低于電刺激組(P<0.05),也明顯低于假手術組(P<0.01),電刺激組低于假手術組(P<0.05)。7日齡干預組與14日齡干預組相比,三組7日齡總時間較14日齡增長(P<0.05),主動回避率及正確反映率7日齡低于14日齡。

2.2 光鏡下腦神經細胞核神經纖維變化 假手術組腦組織各部位的結構及細胞層次清楚、形態正常,核仁核膜明顯,大小無變化,神經元無水腫,未見明顯損傷性改變;模型組新生大鼠腦組織可見明顯的毛細血管出血,可見游離紅細胞,細胞核固縮、核碎裂明顯,模型建立成功,神經元數量明顯減少,正常排列結構消失。電刺激組神經細胞變性壞死較少,多數細胞形態較模型組,相對正常。

2.3 腦皮質和海馬區STAT3蛋白的表達STAT3主要分布于缺血側皮質與海馬,結果顯示假手術組的缺血側及對側前腦均未見到STAT3免疫反應陽性細胞,刺激7、14日齡電刺激組仔鼠腦組織海馬STAT3陽性染色細胞IOD與模型組仔鼠相比較,明顯增加,差異有統計學意義(P<0.01)。模型組、電刺激組7日齡與14日齡IOD相比明顯增加,差異有統計學意義(P<0.01),見表3。

表3 刺激7,14日齡各組大鼠 STAT3的IOD的比較( x±s),n=6

3 討論

近年關于小腦控制運動的傳統觀念正在改變。研究發現,小腦某些部位的損傷不是引起運動障礙,而是快速準確地察覺感官信息的功能受損。此外還發現小腦可能在短時記憶、注意等認知、情緒、任務安排和計劃能力,乃至精神分裂癥和孤獨癥的成因方面都起著重要作用,電刺激小腦頂核可明顯增加大腦血流量,通過抑制經線粒體的細胞編程性死亡而阻斷凋亡[3,4],能顯著地抑制大鼠腦缺血區的神經元凋亡,減少梗死灶及其周圍的白細胞浸潤,使氧自由基的產生減少,避免缺血后細胞的死亡,通過神經源性神經保護作用減輕腦損傷和促進腦功能恢復。新生兒缺氧缺血性腦病是引起新生兒急性死亡和慢性神經系統損傷的主要原因之一。長期以來人們一直以為腦和脊髓的神經元是不能再生的。伴隨著從胚胎期和成年動物及人腦和脊髓中分離、培養出具有向神經膠質細胞和神經元分化潛能細胞的成功可塑性概念的提出,為中樞神經系統的結構功能重建提供新的手段。但如果僅調動內源性神經干細胞試圖修復損傷神經是不夠的,所以必須要有外源性的干預因素促進內源性神經干細胞的活化和增殖,來彌補因缺氧缺血損傷而損失的神經細胞,改善腦功能狀態[5],因而尋找有效的促進神經干細胞增殖的手段越來越受到重視。

神經損傷后軸突再生是目前研究的熱點,信號途徑是其重要的組成部分,神經干細胞對神經修復和再生是通過多種信號轉導途徑實現的[6]。JAKSTAT通路是能夠將細胞外信號快速傳遞至細胞內的信號轉導途徑,同時啟動基因轉錄,STAT3是JAK-STAT信號通路中的重要成員,其存在是神經系統發育和分化的必要條件。在體內STAT3蛋白還具有參與維持神經細胞的存活和促進神經損傷后的再生、維持c-fos基因基礎表達[7,8]。c-fos基因構成學習記憶過程中信號轉導的組成部分,在信號轉導過程中,及早基因轉錄翻譯的蛋白質作為轉錄因子,控制基因合成新的蛋白質。研究表明,長時記憶需要新的蛋白質的合成。故可以通過對STAT3進行研究明確JAK-STAT信號通路對腦缺血損傷中學習記憶能力的影響。本結果顯示電刺激組仔鼠腦組織海馬STAT3陽性染色細胞積分光密度值(IOD)高于模型組,迷宮實驗結果也證實電刺激組大鼠認知記憶明顯優于模型組。說明電刺激可以通過提高STAT3蛋白的表達,提高學習記憶能力,其機制為通過JAK-STAT信號轉導途徑增加及早基因表達,合成學習記憶所需新的蛋白質,促進神經再生和神經元存活,從而改善學習記憶能力。本實驗在整體動物水平上觀察H IBD仔鼠學習能力和工作記憶能力的改善,在神經元的形態結構、亞細胞結構和超微結構上觀察由于電刺激小腦頂核的早期干預保護作用導致的形態結構上改變;并在分子水平上探討了電刺激小腦頂核作用下的H IBD仔鼠海馬神經元STAT3蛋白表達的變化及電刺激小腦頂核可能的作用機制,為缺氧缺血腦損傷患兒臨床治療提供理論依據和臨床指導。由于大腦學習記憶過程是一個非常復雜的過程,所以對于早期干預有益于學習記憶能力機制的探索值得更加系統、深入地開展。

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