金雀異黃素對大鼠血管平滑肌細胞鉀電流的影響

于桂春， 王瀟然， 侯曉華， 周珊珊， 張黎明

目前發現的血管平滑肌細胞(Vascular Smooth Muscle Cells，VSMC)鉀通道主要有4種:電壓依賴性鉀通道(KV)、鈣激活鉀通道(KCa)、內向整流鉀通道(Kir)和ATP敏感的鉀通道(KATP)。其中KCa及KV在數量上要遠多于后兩者。鉀通道對于VSMC的膜電位起著至關重要的調節作用，鉀內流導致膜復極化，是保持靜息膜電位的主要離子流。當VSMC膜去極化時，電壓依賴性鈣通道激活，胞外鈣離子進入胞內，胞內游離鈣離子濃度的升高最終可導致血管平滑肌的收縮［1］。因此，鉀通道在血管平滑肌的舒縮和血管緊張度的維持機制中起著重要作用。鉀通道的病理生理變化表現在許多血管高反應性相關的病理狀態中，如:高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化［2］、蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣［3］等。鉀通道也因而成為眾多藥物的作用靶點之一。酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinase，PTK)抑制劑金雀異黃素(Genistein，GST)是一種來源于豆類植物的異黃酮類化合物，具有抑制腫瘤的生長和轉移，預防心腦血管系統疾病和骨質疏松癥的發生，以及弱的雌激素和抗雌激素等作用［4］。近年來研究發現GST對于離子通道也有快速的調節作用［5～10］。本實驗通過膜片鉗技術，檢測GST對急性分離大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞(Mesenteric arterial smooth muscle cells，MASMC)的鉀電流(IK)以及膜電位的影響，以探討GST對鉀通道的作用機制。

1 材料與方法

1.1 MASMC的制備 腹腔內注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)以麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠(體重150～250g)。取出腸系膜前動脈支配的全段腸系膜，置于生理鹽溶液 (Physiological saline solution，PSS)(mmol/L;137 NaCl，5.4 KCl，0.44 NaH2PO4，0.42 Na2HPO4，4.17 NaHCO3，10 HEPES，通以 95%O2和5%CO2的混合氣體，pH值7.4)中，在體式顯微鏡下剝離出腸系膜前動脈。將3級以下分支剪成長約2mm的小段并轉移到裝有2ml分離液A(PSS中含1.5mg/ml膠原酶/分散酶，0.5mg/ml彈性蛋白酶II-a，1mg/ml胰蛋白酶抑制劑I-s，2mg/ml胎牛血清)的離心管中37℃水浴孵育40min，而后將組織移到裝有2ml分離液 B(PSS中含1mg/ml膠原酶，2mg/ml胎牛血清)的離心管中 37℃水浴孵育40min。經Pasteur管洗脫和吹打后，細胞懸液在含1%青霉素，鏈霉素的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)中4℃培養4h，而后于含10%胎牛血清的DMEM中37℃培養備用。

1.2 膜電流及膜電位的記錄 本實驗全部采用全細胞膜片鉗記錄模式，在電流鉗模式下記錄膜電位，在電壓鉗模式下記錄鉀電流。全部實驗在室溫下進行(22℃)。膜片鉗放大器為 Axopatch-1D(Axon Instruments)，通過 TL-1 DMA(Axon Instruments)進行數據采集，記錄軟件為pClamp，濾波為2 kHz，記錄電極電阻為3～5 MΩ。電極內液 (mmol/L):130 KCl，10 HEPES，1 MgCl2，1 CaCl2，10 EGTA，2 Na2ATP以 KOH調節 pH值為7.2。細胞外液(mmol/L):130 NaCl，5.4 KCl，1.2 MgCl2，1.8 CaCl2，10 HEPES，10 Glucose，以 NaOH 調節 pH 值為7.4。記錄鉀電流時，鉗制電位為 －70mV，從 －80mV至 +50mV，每個刺激持續 2s，每次遞增10mV，刺激間隔為10s。

1.3 主要試劑 Genistein、Daidzein、tyrphostin25購自Calbiochem，配置成100mmol/L的二甲基亞砜儲存液，試驗中二甲基亞砜最終濃度小于0.1%。其他試劑購自Sigma公司。

2 結果

2.1 GST對IK的影響 在電壓鉗模式下，方波脈沖記錄的電流可以被鉀通道阻滯劑四乙胺(Tetraethylammonium TEA)顯著抑制。從電流電壓(I-V)曲線中可以看出，在刺激電位0-+50mV的區間內TEA(1mmol/L)可抑制記錄電流達55%～80%，I-V曲線明顯下移(P＜0.05)。TEA的抑制作用還呈現出快速可逆性以及濃度依賴性，表明所記錄的電流為IK。GST(100μmol/L)可以快速可逆的抑制 IK(P ＜0.05)。tyrphostin25(10μmol/L)也可抑制IK(P＜0.05)，其作用與 GST類似，而 Daidzein(100μmol/L)對 IK沒有顯著影響(P ＞0.05)。

2.2 GST對IK作用的ATP依賴性 GST和tyrphostin 25對IK抑的制作用與細胞內的ATP密切相關。在電極內液不含 ATP的條件下，GST(100μmol/L)和tyrphostin 25(10μmol/L)對IK的影響沒有統計學顯著性(P＞0.05)。

2.3 GST對膜電位的影響 大鼠MASMC的靜息膜電位值為 －45.8±2.5mV(n=15)。TEA 能去極化膜電位，其作用呈可逆性以及濃度依賴性，0.3mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、10mmol/L 的 TEA可去極化膜電位至 －42.4±2.8mV、－41.2±1.8mV、－34.1±1.9mV、－22 ±3.1mV(P ＜0.05)。GST對膜電位的去極化作用也呈現出與TEA類似的可逆性以及濃度依賴性。10μmol/L、30μmol/L、100μmol/L的 GST可去極化膜電位至 －37.2±1.7mV、－29.85 ±1.65mV、－25.25 ±1.95mV(P ＜0.05)。 Daidzein (100μmol/L)、 tyrophostin25(10μmol/L)則對膜電位沒有明顯影響(P＞0.05)。

3 討論

越來越多的研究發現，PTK能調節諸多離子通道活性，包括鈣通道［11］、鈉通道［12］、鉀通道［13］、還有容量激活氯通道［14］。GST作為最常用的PTK抑制劑，也必然能影響離子通道的活性。有學者發現GST能增強人心房肌細胞容量敏感氯電流［5］，抑制大鼠心室肌細胞電壓門控鉀通道［6］，兔心室肌細胞鈉電流［7］。然而GST對離子通道的作用機制仍存在爭議，一些學者認為GST對離子通道的作用與其抑制PTK無關，而是GST直接影響離子通道的結果，其理由在于GST無活性的類似物Daidzein對離子通道也有與GST相似的作用。Weinreich等發現GST可以直接激活豚鼠心室肌細胞囊性纖維變性膜透性調節蛋白氯通道［8］。GST還可直接抑制兔冠狀動脈平滑肌細胞鉀電流［9］，豚鼠心室肌細胞鉀電流［10］。我們研究發現，GST可以抑制大鼠MASMC的IK，而Daidzein對IK的抑制作用不顯著，另一種PTK抑制劑tyrphostin25也可以抑制IK。由此可見，GST對大鼠MASMC的IK抑制作用緣于其對PTK的抑制。

ATP是細胞內蛋白磷酸化的重要底物，蛋白激酶就是將ATP的γ磷酸基轉移到底物特定的氨基酸殘基上，使蛋白質磷酸化的一類磷酸轉移酶。當細胞內ATP缺失時，蛋白磷酸化就不能進行。我們發現當細胞內液不含ATP時，GST和tyrphostin25失去了對IK的抑制作用，這表明GST抑制IK的機制中還涉及蛋白磷酸化。

MASMC的4種鉀通道中，KV通道在PASMC去極化時開放;KCa通道在MASMC細胞內鈣離子濃度升高及細胞去極化時開放，對膜電位水平起負反饋調節作用。生理情況下只有KV通道開放以維持靜息膜電位，而KCa通道處于關閉狀態［15］。KV通道抑制劑可以使SMC顯著去極化，KCa通道抑制劑則對靜息膜電位沒有明顯影響［16］。TEA半數阻斷KCa通道的濃度為 0.2mmol/L［16］，半數阻斷 KV通道的濃度為3.1mmol/L［17］。因此低濃度的TEA對靜息膜電位影響較小，高濃度TEA則可顯著去極化膜電位，本實驗結果也是如此。我們發現，盡管GST和tyrphostin25都可以抑制IK，但只有GST可以濃度依賴性去極化膜電位。表明GST抑制了KV通道，GST對其他鉀通道是否也有抑制作用還不能確定，而tyrphostin25可能影響了KCa通道而對KV通道影響較小。GST和tyrphostin25作為酪氨酸激酶抑制劑，各自有著不同的作用底物。GST能抑制酪氨酸激酶pp60 V-SRC的活性，而對絲氨酸/蘇氨酸激酶、PKA和PKC沒有抑制作用;tyrphostin25則是受體酪氨酸激酶的抑制劑。因此我們推測GST通過抑制pp60 V-SRC的活性間接致使KV通道磷酸化，從而抑制了IK并使MASMC膜電位去極化。

總之，本實驗研究了PTK抑制劑GST對大鼠MASMC的 IK的影響。結果發現GST和 tyrphostin25可以快速可逆的抑制IK，其作用與蛋白磷酸化相關。但僅GST可以濃度依賴性去極化膜電位，tyrphostin25對膜電位影響不顯著。GST抑制IK是一個復雜的過程，除了抑制PTK活性外，還有哪些因子參與其中，最終使哪種鉀通道失活，都需要進一步的研究探討。

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