馬鈴薯脫毒試管苗擴繁常見的污染及防治措施

穆艷娥，王拴福，姬青云，柴生武，鄧利愛，張東紅，石維山

（山西省薯類脫毒研究中心，山西 太原 030006）

利用組織培養技術進行馬鈴薯脫毒試管苗快繁時，常常會出現不同程度的污染，在高溫高濕的情況下污染更為嚴重，導致組織培養工作的失敗，造成嚴重的經濟損失。因此，在組織培養過程中，控制污染是非常重要的技術環節。本文主要從污染的主要病原及癥狀、常見的污染及產生原因方面進行了闡述，并提出了相應的防治措施。

1 主要病原及癥狀

污染產生的病原主要有細菌和真菌兩類。細菌污染的癥狀出現較快，一般在接種1～2天即可出現，表現癥狀為在培養基或材料表面常出現黃色、粉液狀半透明膜狀。真菌污染的癥狀出現比細菌慢，一般在接種5～10天才有所表現，表現癥狀為初期如針狀的霧斑，以后長出菌絲，繼而很快出現黑、白、黃、綠等色的孢子。

2 常見污染及產生的原因

2.1 細菌污染

主要是由于材料本身或培養基滅菌不徹底造成的。接種前如果培養瓶清洗的不干凈而滅菌又不徹底，耐高溫的雜菌不能被殺死，接種前培養基就會被細菌污染；接種時如果工作人員操作不規范，使用未消毒或消毒不徹底的器械或者是用手接觸器皿邊緣或材料，也可導致接種后外植體周圍出現細菌污染。

2.2 真菌污染

接種前培養基就出現了真菌污染，其原因多數是由于封口不嚴或培養基存放的環境中孢子濃度過大造成的；其次，如果母液儲備液被污染，也能引起培養基表面大量真菌污染。接種后初期，培養基表面出現了真菌污染且位置不定，其原因可能是由于超凈工作臺的濾布不潔凈或接種室孢子濃度過大造成的。如果接種后較長時間出現了真菌污染，主要原因是培養材料攜帶了內生菌或封口不嚴造成的。接種后外植體周圍出現真菌污染，主要原因是由于苗源瓶中的苗源已被雜菌感染，但由于感染初期菌源太小，工作人員肉眼不易發現，接種到培養基瓶上從而引起感染；另外，如果苗源瓶表面消毒不徹底，也可將菌帶入接種瓶內而引起感染。

3 防治措施

利用組織培養技術進行馬鈴薯脫毒試管苗快繁是一項無菌操作技術，不僅要求工作人員在操作過程中遵守無菌操作規程，而且培養室、工作人員的衣物以及操作過程中所用的一切用具、培養基、材料等都要求無菌，稍有疏忽就會導致組織培養工作的失敗，造成嚴重的經濟損失。

3.1 接種前消滅污染菌源

3.1.1 消滅容器雜菌，保證容器清潔。洗凈的玻璃容器應發亮，內外壁水膜均勻，瓶壁不掛水珠。瓶蓋也要認真涮洗，清洗干凈后晾干與瓶子一起存放備用。取拿容器時盡量不接觸內壁。

3.1.2 消滅水質雜菌。培養基母液最好用蒸餾水配置，也可用純凈、無色透明、無懸浮物的食用水制作，以減少菌源和避免雜菌滋生蔓延。配置好的母液要置于4℃冰箱中保存。

3.1.3 培養基滅菌。培養基裝入高壓滅菌鍋內滅菌時,升溫初期打開放汽閥將冷空氣充分放盡，待鍋內溫度升至105℃時關閉放汽閥。空氣排不盡易造成高壓低溫現象，達不到滅菌的目的。升溫至120～121℃穩定滅菌20～25 min，但不宜超過30 min，否則易引起培養基凝固不良。為了增強滅菌效果,可以在培養基中加適宜的抗生素。

3.1.4 選擇無污染培養基。把高溫高壓滅菌的培養基置于無菌室內保存，在室溫下放置2～3天，檢查培養基，剔除滅菌不徹底的培養基，選用干凈無菌的培養基。

3.1.5 接種室消毒。接種前，首先對超凈工作臺進行徹底消毒。用75%的酒精棉擦拭超凈工作臺，然后打開紫外燈，照射20 min后關閉紫外燈，開啟風機，用無菌風吹10 min后方可開始工作。定期用紫外線燈光對接種室照射消毒 20 min，以達到殺滅接種室內菌源的目的。

3.1.6 工作人員消毒。工作人員使用的工作服、帽子、口罩等要保持干凈，并定期進行消毒。經常檢查消毒鍋的滅菌質量，若發現問題要立即檢修。

3.2 接種時嚴格無菌操作

3.2.1 仔細觀察待轉基礎苗，確認無污染才能取用。用酒精棉(或酒精布)擦拭待轉瓶苗的外壁，消除附著在瓶外壁上的雜菌后轉入無菌室。

3.2.2 工作人員消毒。工作人員進入無菌室時要洗手、換衣，并戴帽子和口罩，進入后首先要用75%的酒精仔細擦手，然后將工作臺面及臺壁用75%的酒精棉(或酒精布)擦拭消毒。

3.2.3 接種工具消毒。所用的接種工具如鑷子、剪刀、支架都要從外到內、從正到反在酒精燈的外焰上來回消毒冷卻后待用。接種時瓶口靠近酒精燈火焰，每接一瓶所用工具消毒一次。

3.2.4 接種后的培養基瓶口必須封嚴,以減少瓶內與室內空氣的對流，控制氣流傳菌。

3.2.5 超凈工作臺上盡量少放瓶子，接種瓶、苗源瓶

(基礎苗)不能堆放過滿，以保證氣流暢通。

3.3 內生細菌的防治

內生細菌在外植體的初級培養中不易被發現，隨著繼代次數的增加，菌量慢慢累積發展才在培養基上顯現出來。一般可通過在培養基中添加抗生素或抑菌劑來防止和減少細菌等內生菌的污染。在使用抗生素時需要注意以下幾點:（1）對癥下藥；（2）確定最適抑制濃度；（3）確定抗生素在培養基上的作用和穩定性；（4）確定抗生素不會對植物造成傷害或突變。例如，可在培養基加入1 mL/L的慶大霉素。

3.4 接種后嚴格管理

3.4.1 嚴禁非工作人員出入，工作人員入內時必須穿戴清潔工作服并套鞋套(或專用拖鞋)，以控制外界雜菌傳入無菌區。

3.4.2 培養室內光照控制在2000～3000 Lx，每天20～25℃光照16 h。每隔一周用甲醛熏蒸消毒一次，具體做法是將50 mL甲醛倒入15 g左右高錳酸鉀中,密閉接種室門窗24 h，可殺死空氣中的污染菌源。

3.4.3 及時挑出培養室被污染的瓶苗，然后將污染苗用高壓鍋滅菌后。集中遠距離深埋，徹底消滅再侵染源。當特別珍貴、稀少的資源被污染時,如果污染程度較輕，可以對其進行挽救，方法是：先將瓶苗移出培養室,然后用酒精棉將污染處蓋住,用無菌操作剪將未污染的部分剪下來，先用75%的酒精沖洗30 s,再用無菌水沖洗2次,容器表面消毒后移入超凈工作臺,再用0.1%的Hg2CL2浸泡4～10 min,最后用無菌水沖洗3～5次后轉接到新培養基上。處理后的材料要與其他脫毒苗分開放置,觀察一段時間確定無污染再放回原處保存。