先天性人巨細胞病毒肝炎小鼠模型的建立

張 俐,彭 麗,李德麗,孟繁崢

(吉林大學第一醫院兒科,吉林長春 130021）

人巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV）感染在全世界分布,可引起肝臟、神經系統、血液循環系統、泌尿生殖系統等多系統的病變,其中肝臟最常受累及。先天性巨細胞病毒感染的新生兒中,常見的癥狀包括病理性黃疸、高膽紅素血癥、肝脾腫大,有些患兒甚至出現嚴重的肝功能損傷,發展為肝硬化、肝衰竭而死亡。其發病機制的深入探討與治療藥物的篩選與評價,很大程度上依賴于先天性巨細胞病毒肝炎模型的建立與應用,通過建立科學性、實用性、重現性良好的實驗性肝損傷動物模型,對篩選保肝藥物,探索保肝作用原理,具有重要的現實意義。本研究將HCMV經腹腔接種的方式感染生育齡Balb/c雌雄小鼠并配對喂養。在繁殖后,取新生鼠肝組織進行病毒分離、病理學檢查及原位雜交檢測。結果提示:HCMV可垂直傳播給子代,使新生鼠肝臟發生病理改變,在肝組織中可分離到該病毒;原位雜交檢測顯示,病毒核酸存在于受該病毒感染細胞的核內及胞漿內。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物健康純系BALB/C鼠,雌雄各半,10周齡,體重約25-30 g。購自吉林大學實驗動物中心。

1.2 病毒和細胞

HCMV AD169標準株、人胚肺成纖維細胞(HEL）由吉林大學基礎醫學院微生物教研室提供。使用前將病毒在HEL細胞上15-20次傳代,以增加病毒毒力;經預實驗,以6.0log TCID50/ml的病毒作為實驗用毒種。

1.3 主要試劑

主要化學試劑及分子生物學試劑購自北京華美生物工程公司、武漢博士德試劑公司等。

1.4 方法

10周齡健康BALB/C雌鼠50只,雄鼠50只,隨機分為感染組和對照組,雌雄各25只,隨機配對。將HCMV AD169株懸液分別腹腔內注射給感染組雌雄鼠,劑量為6.0 log TCID50/只;將細胞維持液腹腔內注射給對照組小鼠,劑量為1.0 ml/只。在雌鼠分娩后取新生小鼠肝組織進行病毒分離和病理、原位雜交檢測,每項檢測隨機選取感染組和對照組新生小鼠各30只。

1.4.1 病毒分離 病毒分離常規無菌操作下取出新生鼠肝臟制備肝細胞懸液,低速離心后,取上清直接接種至HEL細胞,同時設置正常細胞對照。對出現HCMV特征細胞病變作用者,取培養上清做PCR,檢測HCMV DNA。

1.4.2 病理學分析 取新生鼠肝組織進行病理學分析,用4%甲醛固定新生屬肝組織,常規脫水、石蠟包埋、切片,光學病理學檢查組織病理變化。

1.4.3 原位雜交檢測 原位雜交檢測HCMV探針來自HCMVLA2099-2500 bp(與其他病毒基因無同源序列,地高辛標記）。將感染組和對照組新生鼠肝臟組織石蠟切片脫蠟、滅活內源性過氧化物酶,暴露DNA,100℃核酸變性,加預變性HCMV DNA探針雜交液37℃孵育過夜,加生物素化地高辛抗體,進行親和素-辣根過氧化物酶-DAB顯色,蘇木素復染,光鏡下檢查細胞核或胞質內有棕黃色著色者判為HCMV陽性。

2 結果

2.1 新生小鼠肝組織病毒分離結果

將30份感染組新生小鼠肝組織制成的肝細胞懸液,經不同方式處理后接種細胞進行病毒分離。發現HEL細胞的細胞病變作用主要有如下表現:細胞腫脹,核變大,形成巨大細胞,折光性增強,核內及胞漿內產生大型嗜酸性或嗜堿性包涵體,這些包涵體有暈輪圍繞并與核膜分離。為了進一步確定結果,用PCR法對HEL單層細胞分離培養陽性者檢測HCMV-DNA,亦均得到陽性結果。證明了HCMV可經胎盤垂直傳播至子代小鼠。對照組新生小鼠肝組織HEL單層細胞分離培養以及PCR檢測均為陰性。

2.2 病理學研究

感染組:組織結構大致正常,肝組織中常有點狀或灶狀的壞死,巨核細胞可見。壞死區和匯管區均可見炎細胞浸潤。核內可見“貓頭鷹眼”樣細胞,是由于包涵體偏于一端使細胞呈現貓頭鷹眼樣的改變,。局部肝臟的包膜不同程度增厚。而對照組:肝組織結構正常,個別新生鼠的匯管區見少數炎細胞浸潤,肝細胞有點狀壞死。

2.3 原位雜交技術檢測新生小鼠肝細胞中HCMV DNA

原位雜交技術檢測新生小鼠肝細胞中HCMV DNA HCMV DNA檢測發現在感染組新生小鼠肝細胞(14/30）陽性率為46.67%。對照組均未見陽性的著色。

3 討論

HCMV感染比較廣泛,有研究表明,CMV在嬰兒中的感染率為68.0%[1]。該病毒可長期潛伏在體內,在免疫力減退、胎兒和小嬰兒時期可使多系統、多臟器受累,出現肝炎、貧血、肺炎等,其中以肝損害相對常見且明顯[2]。在嬰幼兒肝炎中有50%為CMV感染[3]。近年來,隨著病毒學、免疫學、分子生物學及臨床病理學研究的發展,CMV感染所致的肝損害的問題日益受到重視。因此,通過有效地對實驗動物進行病毒接種干預,建立HCMV先天性感染導致肝臟損傷的模型,從而對HCMV感染的藥物治療、預防及其他方面的研究具有重要意義。該實驗動物模型的設計應盡量模擬臨床疾病的病理過程,所以建立模型的重要原則之一應是所建立的新生鼠肝炎模型盡量與人類感染HCMV后的情況相似。既往較多應用鼠巨細胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV）感染小鼠模型來作研究HCMV感染。但是,HCMV可以通過胎盤使處于發育中的胚胎發生先天性感染[4],而小鼠經自然途徑被MCMV感染卻不能通過胎盤感染子代。因此,MCMV對于此項研究并不十分適合。

本文將HCMV AD169株接種至生育齡雌雄BALB/C小鼠腹腔內,可以導致成年鼠HCMV原發性感染,但由于此年齡段雌鼠可發生病毒血癥,卻因為對病毒有一定程度的防御抵抗能力而不發病、不死亡。這種情形與人類大多數孕婦原發感染HCMV時常無任何臨床癥狀相似;但病毒卻可經胎盤傳給胎兒。HCMV被認為具有較嚴格的種屬特異性,但HCMV AD169株作為標準毒種已在體外廣泛傳代并冷藏多年;HCMV可經小鼠胎盤垂直傳播至胎兒的腦組織已經被實驗證實[5]。結果表明,BALB/C小鼠用于HCMV先天性感染致新生鼠肝炎模型的優點如下:(1）BALB/C小鼠個體差異小,遺傳背景均一,基因改造技術成熟,且生理生化和發育與人類相似,試驗結果精確可靠,與鼠相關的細胞類型、免疫球蛋白、細胞因子等試劑已商品化,繁殖快,費用和飼養要求低。因此具有較高的可行性、可重復性和經濟性。(2）感染小鼠分娩新生鼠模擬了HCMV在自然宿主中的一些主要先天性感染特征;使該疾病動物模型與人類疾病具有較高的相似性。(3）在新生小鼠肝組織的細胞水平和分子水平上均證實有HCMV感染存在;故該模型研究所獲資料可以證實人類HCMV的垂直傳播導致肝炎。

[1]Gong S,Dong Y.Cytomegalovivus infection in children′s livertissues[J].Tongji Med Univ,1998,18(3）:153.

[2]BolgerG,Lapeyre N,Rheaume M,et al.Acute murinecytomegalovirus infection∶A model for determiningantiviral activity against CMV induced hepatitis[J].Antioiral Res,1999,44(3）∶155.

[3]唐柳平,王 瓊.嬰兒巨細胞病毒感染與肝功能變化的探討[J].中國誤診學雜志,2009,9(25）:6076.

[4]Jr Mocarski E S.Cytomegalovirus Biology and Replication.The Human Herpesviruses[M].New York:Raven Press,Ltd.1993,173.

[5]王明麗,唐久來,胡 聞,等.人巨細胞病毒先天性中樞神經系統感染小鼠模型的建立[J].動物學報,2000,46(2）:167.