奶牛魏氏梭菌病病原的分離鑒定

羅毅

（沈陽市動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽 110034）

魏氏梭菌是革蘭氏陽性大桿菌，屬條件性致病菌，廣泛分布于自然界，是腸道中的常在菌群之一。該菌能產生多種外毒素和酶類，其中，外毒素是主要的致病因子[1]。動物一旦感染，死亡率可達70%~100%。韓彗民等[2]認為能夠造成家畜機體抵抗力下降的因素均能導致魏氏梭菌大量增殖、產生毒素進而侵入血循環系統并導致發病。柴同杰等[3-4]提出同樣的觀點，即動物魏氏梭菌感染導致的猝死癥，主要由腸毒血癥造成機體主要器官的衰竭所致。

2010年11月沈陽市一奶牛小區奶牛發生猝死，死亡奶牛無任何前驅癥狀，突然發病死亡，以全身實質臟器及消化道出血為特征，一周內全群發病死亡。為查找病原，我們采集了有關病料進行了病原分離、鑒定，并進行了動物回歸試驗。現將有關結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來源于沈陽市蘇家屯區一奶牛養殖小區死亡的奶牛，病料主要包括死亡牛的心、肝、脾、肺、腎、小腸等病變組織及腸內容物。

1.1.2 主要試劑 普通瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基購自北京奧博星生物技術有限責任公司；厭氧肉肝湯培養基、綿羊鮮血瓊脂平基均由本實驗室自行配制；VITEK-ANI厭氧菌鑒定卡購自梅里埃公司；革蘭氏染色液購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 試驗動物 實驗用小白鼠購自沈陽醫學院。

1.1.4 主要儀器 VITEK全自動微生物分析系統（VITEK-32，法國梅里埃公司）、生物安全柜（NUAIRE NU-430-600E，美國NUAIRE公司）、高壓蒸汽滅菌器（TOMY SX-700，日本）、生化培養箱（SPX-100B-Z，上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、生物顯微鏡（OLYMPUS-CX31，日本）、電子天平（METTLER-AE240，梅特勒-托利多上海儀器有限公司）、水浴箱（SALVIS-IC240，瑞士）、離心機（SIGMA-3K30，美國）。

1.2 方法

1.2.1 病原分離鑒定

1.2.1.1 形態觀察 無菌操作采取腸內容物、黏膜刮下物、肝、脾做涂片革蘭氏染色，然后進行顯微鏡檢查。

1.2.1.2 分離培養 將腸內容物80℃，水浴15 min，然后2 000 rpm離心15 min，取上清液，一份接種麥康凱瓊脂平皿培養，另一份接入厭氧肉肝湯，在37℃溫箱中培養20~24 h，然后在普通瓊脂平板和綿羊鮮血瓊脂平板上劃線，37℃溫箱進行分離培養。同時將各臟器接種于肉肝湯，厭氧培養，再取培養物接種綿羊鮮血瓊脂平皿培養，挑單個菌落進行純培養同時染色鏡檢。

1.2.1.3 生化試驗 將分離菌純培養物重新接種普通瓊脂培養基，37℃培養20~24 h上卡，用VITEK-32進行檢測。

1.2.2 動物試驗

1.2.2.1 腸毒素檢查 無菌操作取死牛病變明顯的腸內容物，用滅菌生理鹽水進行l:l稀釋后，4℃，3 000 rpm離心10 min，取上清液，再以4℃8 000 rpm離心15 min。然后取上清液腹腔注射16~20 g小白鼠5只，同時設立對照（注射滅菌生理鹽水）2只，l mL/只，72 h內觀察結果。

1.2.2.2 分離菌毒力測定 分離菌接種厭氣肉肝湯中，取20 h的培養物腹腔注射小白鼠0.5 mL/只，注射5只，觀察結果。

2 結果

2.1 病原形態觀察

病死動物的肝臟和腸管內容物革蘭氏染色鏡檢均見到一種革蘭氏染色呈陽性，有莢膜的粗大桿菌，單個或成雙排列。有的有芽孢，位于菌體偏端。純培養的細菌形態為革蘭氏陽性粗大桿菌，個別有芽孢。

2.2 培養特性

加溫處理后的腸內容物在麥康凱瓊脂平皿上無細菌生長，而接入厭氧肉肝湯試管1培養18 h后觀察，可見肉湯形成均勻的混懸液，液面上方靠近液體側試管壁上有2 cm長的石蠟附著。瓊脂平板培養菌落呈灰白色，表面光滑、濕潤、圓盤型，有的有放射狀條文的大菌落，血瓊脂板上有溶血環。

2.3 生化實驗

經VITEK-32進行檢測，結果99%為產氣莢膜桿菌。

2.4 動物實驗

2.4.1 腸毒素檢查結果 腸內容物處理后注射5只小白鼠，24 h內全部死亡，而對照組小白鼠全部存活，證明腸道內容物中有毒素存在。

2.4.2 分離菌培養液的毒力測定 肝片肉湯培養物注射小白鼠，于72 h內全部死亡。死后剖檢見小鼠喉頭、氣管環充血、出血；肺充血、氣腫；心尖端心肌表面有樹枝狀充血；肝臟出血；小腸腸壁松弛、腸粘膜變得薄而透明、漿膜有出血斑、盲腸粘膜有出血斑點、內有稀糞并有氣泡；肝臟腫大、質地脆易碎、呈土黃色；脾臟色深褐；腎臟淤血。

3 討論

近年來，我國魏氏梭菌感染動物致病的報道較多[5-9]，因其死亡率高給養殖戶帶來較大經濟損失。由于魏氏梭菌病一般均是由細菌在腸道內產生毒素引起發病，細菌本身并不一定侵入機體，因此臟器內一般難于分離到此菌，而腸道內菌群又較多，魏氏梭菌又是腸道內的常在菌，故而分離較難，且即使是從腸道分離出此菌也很難區分是否是致病菌，必須結合臨床癥狀和動物實驗綜合來診斷。

魏氏梭菌正常存在于人和動物腸逍內，并不致病，飼養條件突然改變，氣候驟變或擁擠狀態等原因導致腸道細菌菌群紊亂，微生態平衡破壞，魏氏梭菌趁機劇烈地繁殖，瞬間在腸道產生了大量的外毒素，毒素粘附在腸粘膜上皮上，妨礙了氨基酸的吸收和運輸，這時腸壁的通透性升高，使得毒素進入血液循環，引起腸毒血癥，從而導致機體重要器官衰竭[3]。引起動物死亡，此病的發生來勢兇猛，傳播快，發病急劇，死亡迅速，往往來不及治療全群死亡，因此預防是防止該病發生的最好辦法。平時應加強動物的飼養管理，減少動物的應激反應。

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[2]韓慧民，姚湘燕，孟銳奇.家畜猝死癥病因學研究[J].吉林畜牧獸醫，1996，18（4）：22-24.

[3]柴同杰，馬瑞華，常維山，等.產氣莢膜梭狀芽抱桿菌的流行與致病機制[J].中國預防獸醫學報，2001（1）：70-72.

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