豬瘟疫苗免疫綜述

田召芳，李春蕾，張文娟，陳 蕾，王偉濤

（1.煙臺市動物疫病預防與控制中心，山東煙臺 264003；2.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032）

豬瘟是由豬瘟病毒引起的豬的傳染病，遍及世界各地，其特點是傳染性強，發病率極高，死亡率較高。發生過豬瘟疫情的規模場連續傳播的可能性極大，偶有耐過豬只則成為僵豬，失去飼養價值，嚴重威脅著養豬業的發展。目前，對于豬瘟的治療尚未找到有效的方法，用疫苗預防仍然是主要的防控手段。本文主要討論豬瘟疫苗的研究進展、免疫失敗的原因及免疫程序。

1 豬瘟疫苗的研究進展

1.1 傳統疫苗的研究

豬瘟兔化弱毒苗是目前世界上應用最為廣泛的疫苗，包括組織苗（淋脾苗）和細胞苗。

我國1954年成功培育出豬瘟兔化弱毒株并制成疫苗（CLS），也叫“C株”或“K株”。疫苗病毒的復制主要在淋巴樣組織，特別是扁桃體，但有時能從腎臟檢查出苗毒抗原。該苗毒株不通過懷孕豬的胎盤屏障感染胎兒。豬瘟兔化弱毒株毒力不返強，在豬體內連續傳代后仍保持原弱毒的特性。對乳豬和種豬無殘余毒性。接種各年齡的各品種豬，不產生豬瘟臨床癥狀，僅出現輕微病毒血癥，免疫后4~32 d內，免疫豬不從尿中排毒，免疫豬與非免疫豬同圈飼養60 d，不發生接觸感染。檢查免疫豬臟器帶毒情況，證明免疫后7 d的豬體中脾及血尚存微量毒，17 d以后，免疫豬的血液、脾及骨髓中已均無病毒存在。免疫10~14日齡哺乳仔豬，不影響發育，注射懷孕1~3月齡母豬，不引起流產、死胎。

我國在1957年開始推廣豬瘟兔化弱毒組織苗，最初提倡就地制苗，就地使用。繼而真空冷凍干燥苗技術研制成功，凍干苗便于保存，成為我國防制豬瘟的有力工具。并開始采用家兔淋脾組織制苗。后又將豬瘟兔化弱毒接種牛，病毒可在牛體內繁殖，淋脾毒價可達到乳兔水平，便于就地制苗或生產廠制凍干苗。1974年黑龍江獸醫研究所用原代豬腎細胞培養兔化弱毒制苗，獲得成功。1975年開始由中國獸醫藥品監察所組織全國獸醫藥品廠進行病毒型疫苗轉入細胞培養制苗的技術革新，將兔化弱毒接種原代腎細胞進行工廠化制苗。為了避免用同源細胞生產疫苗有污染強毒的危險，1980年研制成功綿羊腎細胞苗，1982年奶山羊腎細胞苗和1985年犢牛睪丸細胞苗研制成功，為豬瘟疫苗生產開辟了一條新的道路。羊腎和犢牛睪丸細胞苗接種豬后3 d可產生免疫力，5 d可產生堅強的免疫力，免疫期一年。

除我國豬瘟兔化弱毒苗（C株）以外，日本的細胞弱毒苗（GPE-株）和法國的細胞弱毒苗（Thiverval株）也在一些國家使用。

1.2 豬瘟ST傳代細胞系疫苗

中國獸醫藥品監察所等選擇了一種對豬等動物安全、適宜于豬瘟病毒增殖的傳代細胞系，將ST細胞系感染裸鼠，觀察近100 d，沒有發現致瘤現象，也沒有觀察到組織病理變化，將該細胞連傳20多代，沒有染色體變化。證明細胞是安全的。豬瘟兔化弱毒病毒在該細胞中能實現高滴度增殖，通常情況下，每毫升細胞疫苗毒液的毒價能穩定在50到100萬個兔體感染量，如果采用生物反應器，則可達到300萬倍左右，是原代牛睪丸細胞豬瘟疫苗毒價的10~50倍。由于豬瘟兔化弱毒良好的安全性，高病毒含量的傳代疫苗對豬安全。免疫效力檢驗結果顯示，將該疫苗做5 000倍稀釋免疫豬，仍能100%抵抗強毒的攻擊。高出牛睪丸原代細胞生產的疫苗近20倍。實驗室免疫接種一次免疫期可以達到一年以上。部分省市推廣應用效果良好。

1.3 基因工程亞單位疫苗

Hulst等[1]將Brescia株E2基因置于PRV的gX基因信號肽之后，構入桿狀病毒AcNPV多角體啟動子p10調控序列之下，構建了能表達E2蛋白的重組桿狀病毒BacE1±（即pAcAS3gXE1±TMR），并在昆蟲細胞sf21中成功表達。將BacE1-感染sf21細胞后表達純化的20μg E2蛋白免疫豬，能很快產生很高的抗體效價，且能完全抵抗100LD50的CSFV Brescia強毒株的攻擊，其誘導出的中和抗體效價（Neutralizing peroxidase-linked antibody，NPLA）大于3 000，遠高于CSFV弱毒疫苗C株誘導的NPLA（NPLA≥50即可使豬得免疫保護）。

Van Rijn等利用桿狀病毒表達系統表達了兩種分別缺失了B/C抗原單位和A抗原單位的突變E2蛋白，其免疫豬后進行攻毒試驗，結果表明，E2蛋白上的一個結構抗原單位誘導的免疫反應就能夠保護豬抵抗CSFV的攻擊。Van Rijn PA等將E2基因N端含A和BC抗原表位而不含TMR的部分構入桿狀病毒，用其表達產物進行免疫實驗，證明無TMR的E2表達產物能保護同源病毒的攻擊，單一A或BC區也能保護。桿狀病毒表達體系表達E2，可望成為一個新的最為安全有效的亞單位疫苗。

1.4 病毒活載體疫苗

以無致病力或低毒力的痘苗病毒（VAC）和偽狂犬病毒（PRV）或腺病毒為載體，將豬瘟病毒E2基因與之重組研制出的基因重組疫苗，免疫動物后可對二種病毒產生良好的保護力。

Hahn J等[2]將E2基因和偽狂犬病毒gX信號肽序列置于豬痘病毒P11啟動子之下，構建了表達E2的重組豬痘病毒（recombinant swinepox virus），該重組病毒表達的E2蛋白以二聚體的形式分泌到感染細胞的胞漿中。

Hooft等將CSFV E2基因插入PRV的糖蛋白gE基因位點，并分別置于不同啟動子控制之下，比較了這些啟動子對表達水平的影響，發現用人巨細胞病毒的立即早期基因啟動子的效果最好，用它構建的E2重組疫苗對豬的免疫效果最好。為了使研制的豬瘟病毒活載體更安全，最近Peeter等利用偽狂犬病毒囊膜糖蛋白gD具有病毒侵入宿主細胞所必需但并不為病毒在細胞內的擴散所必需的特性。構建了能表達豬瘟病毒E2蛋白的gD/gE雙缺失的偽狂犬病毒重組疫苗，免疫接種試驗表明該活載體疫苗能使豬獲得對偽狂犬和豬瘟的雙重保護。因此目前國內外在運用PRV作為活病毒載體疫苗的研究比較活躍。

另外，還有人進行了用腺病毒表達E2蛋白的嘗試。Hammond JM等[3]將CSFV Weybrdge株的E2基因插入進PAV血清型3的基因組中，置于主要晚期啟動子的調控之下，構建了含E2基因的重組腺病毒rPAV-gp55，并用其進行動物實驗，一次接種就能使豬得到良好的保護，皮下免疫可獲得100%的保護。且免疫攻毒豬無臨床癥狀，剖檢無病變。

1.5 DNA疫苗

DNA疫苗可以誘導體液免疫，又可誘導細胞免疫，通過初步田間試驗，已經顯示了較好的免疫力。

Hammond JM等[4]在構建含E2基因的重組腺病毒（rPAV-gp55）后，又構建了一株含E2基因的裸質粒DNA（naked plasmid DNA）疫苗，并用其作基礎免疫后再用rPAV-gp55作二次免疫，然后再用強毒攻擊，保護效果比單用rPAV-gp55免疫好，單用rPAV-gp55后攻毒有輕微體溫反應，而聯用無體溫反應，脾、淋巴結剖檢無病變。余興龍、涂長春等用pIRESlneo構建了一株含E2基因的真核表達質粒pcDSW并用其制備了抗CSFV的單抗，并用豬瘟DNA疫苗成功保護了豬瘟強毒對豬的攻擊。但是，Markowska等用DNA疫苗免疫保護實驗表明，強毒攻擊后體溫反應有2天高于40℃，T、B淋巴細胞活性有輕微上升。盡管如此，以E2作為免疫基因構建的CSFV DNA疫苗已顯示出了誘人的前景。

1.6 標記疫苗的應用研究

Moormann等[5]將CSFV C株gp55的N端序列用Brescia株相應部分替代，構建了一株雜交病毒株Flc-h6，用現有的抗E0和E2的單抗，可把Flc-h6與強毒Brescia及疫苗C株分開。用Flc-h6作為疫苗免疫豬，可以方便地將疫苗株與野毒感染豬分開。Dewulf J等做了亞單位標記疫苗的保護試驗，對照組有40%出現死亡并出現臨床癥狀，而免疫組能抵抗強毒攻擊。另外的研究又表明，E2亞單位標記疫苗不能使豬獲得完全保護，不能完全抵抗病毒感染和排毒的研究結果。

更加完善的研究也正在進行，Widjojoatmodio MN等構建了Flc23（缺失E0中215位AA）和Flc22（缺失E0中66位AA）兩株重組病毒，能在SK6c26細胞上增殖，但不能產生感染性病毒，用其免疫豬后能產生抗E0的中和性抗體，抵抗Brescia強毒株的攻擊。后該組人員又用缺失E2基因中B/C區域（Flc4）或A區域（Flc48）的非傳播性標記疫苗（non-transmissible marker vaccines）鼻內接種進行免疫，攻毒后可獲得全部或部分保護。

2 豬瘟免疫失敗的原因

2.1 母豬持續感染與垂直傳播

持續感染母豬經胎盤垂直傳播HCV是給仔豬造成免疫失敗的一個重要因素[6]。這種持續感染的HCV可在母豬體內維持750 d以上甚至終身存在，帶毒母豬產下的似乎健康的先天性感染仔豬可在長達數月之久排出大量豬瘟病毒而不表現出癥狀，也檢測不出豬瘟抗體。帶毒母豬綜合征在妊娠母豬的感染率可達43%。妊娠母豬感染豬瘟病毒后，在整個妊娠期都可通過胎盤傳播。病毒是由血液通過胎盤屏障傳給胎兒的，傳播率達45%~86%。吃初乳和接種豬瘟疫苗不能阻止帶毒仔豬的死亡。免疫HCV不能使帶毒仔豬產生免疫保護力，即仔豬先天性免疫耐受，強毒攻擊可引起死亡。HCV垂直傳播的帶毒豬可發生水平傳播。HCV持續感染可引起母豬生殖系統病理變化導致繁殖障礙隨胎次增加而加強。

2.2 帶毒公豬的垂直傳播

用RT-PCR檢查帶毒公豬自然交配所產死胎的病毒基因型，結果表明[7]：死胎感染的病毒基因型與帶毒母豬原有的病毒基因型不同，而與帶毒公豬的病毒基因型相同。證明帶毒種豬不僅能通過母豬胎盤垂直傳播，而且能通過公豬精液垂直傳播，這是造成豬瘟持續感染的又一重要原因。

2.3 母源抗體的影響

當母源抗體水平在1:16時，使用2個免疫劑量疫苗接種3頭豬，在強毒攻擊后，雖然這些豬均存活下來了，但3頭豬均有持續24~72 h的潛伏期，體溫升高1.5~2℃，持續2.5~8 d，而使用4個劑量免疫接種的3頭豬，僅1頭體溫升高2℃，持續時間僅為2.5 d。其他兩頭豬既無潛伏期，又無體溫升高。試驗表明，提高疫苗中的病毒含量對母源抗體不整齊的豬場的豬瘟控制是非常必要的。

目前歐洲為了消滅豬瘟的亞臨床感染，多采用加大免疫劑量的方法。歐洲藥典規定用C株疫苗免疫時，肌肉注射劑量為100PD50（400RID）。我國豬瘟細胞苗出廠檢驗以5萬倍稀釋能致兔體熱反應為合格，即每mL原液含5萬個RID，規定的免疫劑量為150 RID（含37PD50），遠遠低于國際標準，況且我國豬場中存在的豬瘟持續感染問題和其他病原混合感染的問題比發達國家嚴重的多，使用常規免疫劑量預防接種，在母源抗體參差不齊和有豬瘟病毒持續感染的豬場，往往會造成免疫失敗。

2.4 非豬瘟病毒感染對豬瘟疫苗免疫效果的影響

利用20頭9月齡左右豬瘟、偽狂犬、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥抗原、抗體陰性豬，將其分成6組，分別利用豬細小病毒（PPV）、豬偽狂犬病毒（PRV）和豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒（PRRSV）單獨或混合感染，7 d后，連同對照豬4頭，免疫接種豬瘟兔化弱毒疫苗（HCLV），13 d后連同4頭陰性對照豬一起攻擊豬瘟石門強毒。整個試驗期間分別每天測溫，觀察臨床癥狀，每周采集扁桃體和血樣做各種病毒抗原及抗體檢測。結果在攻擊石門強毒后2周，單獨和混合感染了非豬瘟病毒后接種HCLV疫苗的4個免疫組12頭豬除1頭外，11頭全為HCV抗原檢測陽性，且多呈強陽性；而單一HCLV疫苗免疫組在豬瘟強毒攻擊后檢測不到HCV；所有HCLV疫苗免疫豬均存活，而非免疫對照組4頭豬全部在攻毒16日內死亡。試驗表明非豬瘟病毒感染的確對豬瘟疫苗免疫效果有影響，能造成豬瘟疫苗免疫的失敗[8]。

2.5 疫苗質量對免疫效果的影響

我國的豬瘟疫苗存在兩大問題，一是疫苗中病毒含量低。在脾淋組織疫苗方面，我國現有豬瘟兔脾淋組織疫苗工藝落后，制造疫苗所需的大耳白兔子數量太少，而且由于品種退化的原因，遠遠滿足不了需要，同時效力檢驗的標準太低；在牛睪丸原代細胞疫苗方面存在的問題更大，我們現有的標準只有歐洲等發達國家的1/4，病毒含量太低，在其他疾病混合感染，母源抗體存在的情況下，很難達到應有的免疫效果。除此之外，由于牛感染BVDV非常普遍，有牛睪丸原代細胞生成疫苗，不可避免的會遭到BVDV污染，污染了這種病毒，一是直接影響病毒在細胞中的增殖，同時還會造成BVDV疾病的傳播，直接影響胎兒存活。運輸的冷鏈系統不完善導致豬瘟病毒存活力降低也是引起豬瘟免疫失敗的重要原因。

3 免疫接種程序

目前國內還沒有統一的豬瘟免疫程序，各地養豬場的免疫程序大同小異，其基本情況大致有三種。

3.1 種豬集中統一免疫

種公豬、種母豬每年集中統一免疫兩次。仔豬21~25日齡左右首次免疫，50~60日齡左右加強免疫。

此程序必須經常對仔豬的母源抗體進行監測，隨時調整仔豬的首免時間。可通過1~2年的監測，找到本場仔豬的母源抗體消長規律，從而確定時間。

3.2 斷奶時母豬與仔豬同時免疫

種公豬每年集中統一免疫兩次，種母豬斷奶后與其仔豬同時免疫，仔豬50~60日齡左右加強免疫一次。

采用這個程序時，最好也是先測定仔豬斷奶時的母源抗體效價，再確定免疫時間與母豬、仔豬的免疫劑量。仔豬母源抗體在1:32以上時，以4頭份疫苗劑量的免疫效果最佳。

3.3 超前免疫

種公豬、種母豬每年集中統一免疫兩次。仔豬吸吮初乳前進行免疫，注射后1~2 h讓其自由吮奶[9]，30~40日齡時加強免疫一次。

由于超前免疫存在勞動量大，難以實施等缺點，非疫區可不進行超前免疫，但應加強分娩豬舍的消毒，加強母豬的抗體檢測，確保母豬健康。空懷母豬的抗體水平不低于1:64，分娩母豬的抗體水平不低于1:32。對反復接種抗體水平仍然很低的母豬及帶毒母豬應徹底淘汰。

[1]Hulst M M，Westra D F，Wensvoort G，et a1.Glycoproteis E1 of hog cholera virus expressed in insect cells protects swine from hog cholera[J].Journal of Virology，1993，67（9）：5435-5442.

[2]Hahn J，Park S H，Song J Y，et a1.Construction of recombinant swinepox viruses and expression of the classical swine fever virus E2 protein[J].J Virol Methods，2001，93（1/2）：49-56.

[3]Hammond J M，Jansen E S，Morrissy C J，et a1.Oral and sub-CU-taneous Vaccination of commercial pigs with a recombinant porcine adenovirus expressing the classical swine fever virus gp55 gene[J].Arch Virol，2001，146（9）：1787-1793.

[4]Hammond J M，McCoy R J，Jansen E S，et a1.Vaccination with a single dose of a recombinant porcine adenovirus expressing the classical swine fever virus gp55（E2）gene protects pigs agains Classical swine fever[J].Vaccine，2000，18（11/12）：1040-1050.

[5]Moormann R J，Bouma A，Kramps J A，et a1.Development of a classicsl swine fever subunit marker vaccine and companion diagnostic test[J].Vet Microbiol，2000，73（2/3）：209-219.

[6]呂宗吉，涂長春，余興龍，等.我國豬瘟的流行病學現狀分析[J].中國預防獸醫學報，2001，23（4）：300-302.

[7]王琴，寧宜寶.豬瘟免疫失敗主要原因的解析[J].中國獸醫雜志，2005（6）：61-63.

[8]劉忠琛，黑立新，阿爾孜.豬瘟免疫失敗的原因及解決辦法[J].河南畜牧獸醫，2004，25（6）：16-17.

[9]丘惠探，麥志均，粱健堯，等.豬瘟不同順序零天免疫的免疫效果比較[J].中國預防獸醫學報，2001，23（2）：125-127.