影響肉品嫩度的因素及其候選基因的研究進展

李欣蔚，張 勇

（沈陽農業大學畜牧獸醫學院，沈陽 110161）

人類對肉食質量的感知是在咀嚼的過程中，肉食發生復雜物理化學變化，并刺激口腔和鼻腔內感覺神經末梢而產生的。在諸多的主觀感覺因素中嫩度是最重要的。嫩度是豬肉品質結構特性的反映。客觀評定嫩度通常用肉的剪切力值來表示。

1 骨骼肌結構與肉品品質的關系

1.1 肌纖維直徑與肉質

諸多研究表明，肌纖維直徑越小，肉質越嫩；肌纖維直徑越大，肉質越差。川井田博、曾勇慶、吳德等分別對豬的纖維直徑與肉質之間的關系進行了研究，結果表明，纖維直徑與肉品的柔嫩度密切相關，且我國地方豬種肌纖維直徑比引進豬種的肌纖維直徑要細，相應的肉品嫩度較好[1-3]。與此同時，肌纖維直徑與肌肉嫩度的關系已被廣大學者應用于禽肉嫩度的研究中，經試驗證實后得到相同結論。

1.2 肌纖維密度與肉質

有研究證明，隨著肌纖維的增粗，肌肉間結締組織與脂肪含量增加，肌纖維密度下降；骨骼肌肌纖維越細，肌束內肌纖維越密，肉質也越嫩。Ashmore,Suzuki和Johnsfone在所建立的動物肌肉生長模式中指出，動物出生后肌纖維數保持不變。因此，家畜出生后肌肉體積的增加主要是由于已存在肌纖維體積的增大[4-6]。近年來，諸多學者針對肌纖維密度與肉質的關系，以豬、牛等為實驗動物進行大量實驗。Veiseth-Kent,E等認為肌纖維越細，肌纖維密度大，肌肉脂肪含量高，肉質越嫩[5]。

1.3 結締組織、脂肪組織的分布與肉質

1.3.1 結締組織的性質和含量

構成結締組織的主要成分是膠原纖維蛋白，存在于肌外膜、肌束膜和肌內膜，肌腱中更多，且在酸堿環境中可膨脹；彈性纖維蛋白存在于肌肉血管壁、韌帶等；網狀蛋白存在于任何組織中，含量少。大量研究證實，肉品嫩度同結締組織中的膠原纖維和彈性纖維的含量顯著相關。Aberle等（1981）發現，牛肉膠原蛋白的溶解性降低時，牛肉的嫩度隨之下降[7]。

此外，肌肉中的結締組織含量、結締組織中膠原蛋白的種類和交聯程度是影響肉嫩度的重要因素。膠原蛋白中最重要的交聯反應是賴氨酸分子在賴氨酰氧化酶作用下，氧化脫氨形成醛基，與另一賴氨酸分子的氨基縮合形成醛亞胺鍵（CH=N-CH2）。這種分子鍵的交聯作用是使膠原蛋白具有必要的韌性和強度。隨著動物年齡增長，體內膠原蛋白的總量并不明顯增加，但膠原蛋白的交聯更加穩定，因而肌肉就更粗糙，嫩度更低。

1.3.2 脂肪的含量和分布

一般認為，肌內脂肪含量對豬肉品質影響較大，尤其是嫩度和多汁性。Herry等（1963）報道，豬肉大理石紋與肉嫩度的相關系數r=0.62。Fernandez等（1999）研究了杜洛克×大白雜種閹公豬腰大肌肌內脂肪對大理石紋評分及肉嫩度的影響，結果表明，隨著肌內脂肪含量的增加，大理石紋評分也相應的提高，且顯著（P＜0.01）[8]。肌肉中的脂肪組織大部分分布在肌束膜上，肌間脂肪對肌肉的嫩化作用有一種解釋：它分割并稀釋了結締組織纖維，使其更適合熱處理，熱加工時，脂肪細胞破裂，脂肪顯著的進行再分布，融化的脂肪會產生令人滿意的口感增加肉的美味。Wood等認為，肌肉內脂肪是通過2方面的作用來改善肉的嫩度。一是切斷了肌纖維束間的交聯結構；二是有利于咀嚼過程中肌纖維的斷裂[9]。

1.4 肌纖維類型與肉品嫩度

肌纖維類型可直接通過肌纖維直徑或間接通過對肌內脂肪的影響，在一定程度上影響肌肉的嫩度。就肌纖維直徑而言，I型纖維直徑較細，而2b型纖維直徑較粗。因此，在相同屠宰和儲藏條件下，肌肉2b型纖維比例增大，會增加肌肉的剪切力，從而降低肉品嫩度。漢普夏豬與瑞典約克夏豬相比，肉質更嫩，就是由于約克夏豬種酵解型肌纖維所占比例較高。

2 鈣蛋白酶系統的研究進展與致嫩機理

2.1 鈣蛋白酶的結構與生物學特性

廣泛存在的鈣蛋白酶（calpain）有2種，μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶，兩者均由不均一的二聚體蛋白構成，其大、小亞基的分子質量分別為80和30 ku。大亞基具有催化活性，μ-Calpain與m-Calpain的大亞基分別由CAPN1和CAPN2基因編碼；小亞基具有調節功能。盡管μ-Calpain和m-Calpain大亞基氨基酸序列有明顯差異，但是其高級結構基本相同，都由4個結構域組成，從N端起分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ結構域。在大亞基中，結構域Ⅰ由1～80位氨基酸殘基組成，約占全部分子的10%，在蛋白酶激活的情況下很容易發生自溶，由此推測其可能起鈣蛋白酶的活性調節作用，μ-Calpain和m-Calpain僅在結構域Ⅰ中不同；結構域Ⅱ含有81～330位氨基酸殘基，約占全部分子的35%，是表現鈣蛋白酶水解活性的關鍵部位，在未被激活的條件下含有2個次級區域；結構域Ⅲ由351～560位氨基酸殘基組成，約占全部分子的35%，其功能為結合鈣離子和磷脂，與蛋白酶調控亞基或其他調控蛋白有關；結構域Ⅳ由561～705位氨基酸殘基組成，占全部分子的20%，是結合鈣離子的部位，含有4個鈣結合蛋白所持有的EF-手型結構。

鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）是細胞內專一抑制Calpain活性的蛋白質。通過抑制Calpain的活性，可抑制肌肉內蛋白質降解，參與肌肉生長過程中蛋白質的更新。Calpastatin蛋白共由5個部分（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）組成，其中4個是Calpastatin蛋白的活性中心。當Calpain被鈣離子激活后，如果附近有Calpastatin存在，則將迅速與之結合而抑制Calpain活性，從而保證Calpain對底物只進行局部的特定位點的水解。

2.2 鈣蛋白酶致嫩機理

μ-Calpain和m-Calpain都能水解肌原纖維。其可能機制是，鈣蛋白酶被激活后，首先攻擊肌原纖維的肌節（2個相鄰Z盤之間的一段肌原纖維）的部位，釋放肌絲使降解為小片段，然后被溶酶體所捕獲而進一步降解。由于連接蛋白和半肌動蛋白分別以N、C末端和Z盤結合，其多肽鏈分別從I帶延伸到A帶，起著使粗絲、細絲和Z盤牢固結合的作用。但近期研究發現，鈣蛋白酶首先水解的是N2線，據報道N2線是連接蛋白和半肌動蛋白所在區域，它們分別連接粗肌絲和細肌絲，最終通過I帶伸向Z盤。在降解N2線的同時也會降解一些骨架蛋白，使肌纖維釋放肌絲。細肌絲的肌原蛋白和原肌球蛋白及粗肌絲的C-蛋白降解，分別解離出肌球蛋白和肌動蛋白。釋放出的粗肌絲和細肌絲可與母體或其他肌原纖維重新裝配，也可以被胞質蛋白酶或溶酶體降解，導致肌原纖維的有序結構被破壞，從而有利于肉的嫩化。但在宰后成熟的過程中m-Calpain的活性幾乎不變，而μ-Calpain的活性則顯著下降。因此，人們普遍接受μ-Calpain而不是m-Calpain參與了肉的嫩化。并且μ-Calpain的自溶和失活是分子間過程，即使自溶程度很大，它也能完全失活；m-Calpain的自溶是分子內過程，自溶會導致m-Calpain不完全失活。所以，μ-Calpain是蛋白質降解過程中引起肉嫩化的主要酶。

鈣蛋白酶抑制蛋白是通過抑制鈣蛋白酶的自溶作用而發揮作用的，且這種抑制作用并不受pH的影響。Koohmaraie指出，可用牛肉宰后24 h鈣蛋白酶抑制蛋白的濃度來預測最終嫩度。Senky指出豬肉宰后1 h的鈣蛋白抑制蛋白濃度與成熟肉的嫩度正相關，相關系數r=0.263,即可用鈣蛋白酶水平預測60%的嫩度水平。

3 影響嫩度的候選基因的研究進展

3.1 MyoD基因家族

哺乳動物肌纖維在胚胎形成過程中受到MyoD家族的調控。MyoD家族包括MyoDⅠ、MYOD（myogenin,肌細胞生成素）、myf-5和myf-6。它們編碼堿性螺旋—環—螺旋蛋白，通過調節肌肉分化階段特異性蛋白的表達來參與肌細胞的分化。其中myf-5和MyoDⅠ在肌細胞增殖過程中表達；MyoDⅠ在肌細胞分化末期表達；而myf-6主要在生后表達。Soumillion等利用4種人MyoD cDNA混合片段掃描豬基因組確定了MYOG基因，并發現了3個MspⅠ多態性位點[10]。MYOG可能與出生重、生長速度、胴體瘦肉率有關。Liu等研究發現，p204蛋白對成肌纖維分化是必須的，是通過解除Id蛋白（DNA結合抑制劑）對MyoD和E47蛋白活動的抑制而實現的[11]。

3.2 宰后肌肉蛋白水解因子——組織蛋白酶B

作為一類重要的蛋白酶，組織蛋白酶在生物體內最重要的生理功能就是水解特定的蛋白質，在活體內主要承擔水解胞內代謝廢物以及異物的功能。Calkins等報道，組織蛋白酶B在牛肉成熟的1～14 d和3～6 d內，對剪切力降低的貢獻率分別為35%和58%。另外，組織蛋白酶能將肌肉中的某些蛋白質成分分解成質量不等的肽類和游離氨基酸，進而降解成醛類和酮類化合物，這些成分均是食品肉類、干腌火腿中的風味成分。Russo等提出應該將組織蛋白酶B作為影響豬肉嫩度性狀的候選基因加以研究。

組織蛋白酶B具有限制底物進入它們的活性中心的特征。其成熟蛋白結構中有一18個氨基酸長的閉塞環，阻止底物進入位于主要結合區的活性位點，并且提供2個組氨酸His119和His111來結合底物C-末端的帶有陰性電荷的羧基團，這可以部分解釋組織蛋白酶B比該家族其他成員具有相對較弱的內肽酶活性和其獨特的羧肽酶活性。

3.3 肌內脂肪的候選基因

3.3.1 心臟脂肪酸結合蛋白基因

心臟脂肪酸結合蛋白（H-FABP）主要在心肌和骨骼肌中表達。Gerbens等用豬/鼠細胞雜交克隆板的方法將H-FABP定位于6號染色體；他們對純種杜洛克豬的研究發現3個與肌內脂肪有顯著相關的H-FABP多態性位點。他們的研究還表明，肌內脂肪與H-FABP存在顯著相關。國內的林萬華等對中外10個豬種H-FABP遺傳變異進行了研究，發現6個地方豬種均表現為dd型，而外國豬種和培育豬種南昌豬則表現出多態性，這些多態性是否可作為遺傳標記還有待于進一步研究。這些研究結果提示H-FABP極有可能是肌內脂肪的候選基因。

3.3.2 脂肪組織脂肪酸結合蛋白基因

Gerbens等分離了脂肪組織脂肪酸結合蛋白（A-FABP）基因，并進行了測序。A-FABP在人、小鼠和大鼠之間高度保守，尤其是所有功能部位的氨基酸序列都是高度保守的。A-FABP被定位于豬4號染色體。Gerbens等對純種杜洛克豬的研究表明，A-FABP多態性與IMF間存在顯著相關。Gerbens等在10個基因型豬群中檢測到6個微衛星等位基因，其中A6A9較其他基因型的肌內脂肪含量較高。巧合的是這2個A6A9基因型個體與其MspI PCRRFLP的aa基因型表現相同。他們還研究了H-FABP、A-FABP mRNA和蛋白質表達水平與肌內脂肪含量的關系。結果表明，A-FABP mRNA和蛋白質表達水平與肌內脂肪之間沒有顯著相關。H-FABP mRNA表達水平與肌內脂肪含量之間沒有顯著相關。H-FABP mRNA表達水平與肌內脂肪含量差異有關，但在蛋白質表達水平上各基因型間沒有顯著差異。總之，還不能從其表達水平上解釋2種FABP與肌內脂肪遺傳變異之間的關系。但他們仍然認為FABP mRNA和蛋白質表達水平與肌內脂肪含量有關。

3.4 鈣蛋白酶家族基因

根據鈣蛋白酶表現半最高活性所需的Ca2+濃度的不同，可以將普遍存在的鈣蛋白酶分為2種：一種為μ-calpain (又稱calpain I)，激活所需Ca2+濃度為微摩爾級；另一種為m-calpain (又稱calpain II)，激活所需Ca2+濃度為毫摩爾級。已經鑒定了μ-calpain-1兩種同工型cDNA的核苷酸序列。豬CAPN1A cDNA開放讀碼框架約2142 bp，與人和牛的分別有92%和94%的同源性；CAPN1B cDNA開放讀碼框架約1941 bp，它與CAPN1A cDNA前1941個堿基完全相同。用2點連鎖分析法，μ-calpain基因被定位于2號染色體上。

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