表沒食子兒茶素沒食子酸酯對亞硫酸鹽誘導的心肌細胞氧化損傷的抑制作用

趙良淵，張秋華

(1.山西醫科大學藥學院，山西太原 030001;2.山西大學環境與資源學院 030006)

綠茶常被稱為是天然的抗氧化劑，含有很多種酚類物質，其中以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量最高且生物活性最強。流行病學調查和實驗室研究表明，EGCG具有清除自由基、抗氧化、抗癌、抗腫瘤等功效［1-2］，如在日本等飲茶較多的國家或地區，冠心病等心血管疾病的發病率是非常低的［3］。近年來，關于EGCG 的抗氧化機制被廣泛接受的是具有較強的抗氧化能力［4］。關于EGCG對心血管系統的保護機制報道不多，本實驗主要研究了EGCG對亞硫酸鹽誘導心肌細胞氧化損傷的抑制作用。

1 材料與方法

1.1動物實驗動物Wistar大鼠，200～300 g，♀♂不限，由山西省中醫藥研究院動物房提供。

1.2大鼠心肌細胞的分離Wistar大鼠，體質量200～300 g，♀♂不限，具體分離方法見參照Wei等［5］。所有實驗應在細胞分離后的12 h內完成。

1.3試劑亞硫酸鈉(Na2SO3)，亞硫酸氫鈉(NaHSO3)，牛磺酸(Tau)，L-谷氨酸(L-Glu)，牛血清蛋白(BSA)，HEPES，MgATP，CsCl，EGTA，EGCG 購 自 Sigma 公 司 (純 度 ＞99.8%)，膠原酶P(Collagenase P)購自Roche公司，其它試劑均為國產分析純。配制2 mol·L-1的NaHSO3和Na2SO3混合液(二者摩爾比為1∶3)、2 g·L-1EGCG的母液，實驗前稀釋到需要濃度。

1.4SOD、CAT、GPx活性的測定消化結束后，取分離完成的細胞懸液2 ml，先用10 μmol·L-1的亞硫酸鹽染毒30 min，后分別加入 10、30、50 mg·L-1EGCG 處理 40 min。染毒結束后用超聲波細胞破碎儀破碎細胞，于4℃ 4 000 r·min-1離心15 min。取上清液，測定總SOD，CAT，GPx的活性(按試劑盒說明書操作)。實驗同時設對照和亞硫酸鹽單獨染毒各一組。

1.5·含量的測定同樣取細胞破碎上清液，按照南京建成試劑盒測定H2O2，OH·及含量。

1.6 數據分析所有試驗結果用±s表示，用one-way ANOVA檢驗進行統計分析。

2 結果

2.1 EGCG對SOD活性的影響10 μmol·L-1的亞硫酸鹽明顯降低了SOD的活性(12.69±0.14)U·ml-1，與對照相比(23.83±0.23)U·ml-1(P＜0.01)，差異有顯著性。在加入10、30、50 mg·L-1的EGCG后，SOD活性隨著EGCG濃度的增加逐漸回升，其含量分別為對照的63%，67%和86%。EGCG 50 mg·L-1時SOD活性與對照相比差異無顯著性(P＞0.05)，但是與亞硫酸鹽單獨作用比較，差異有顯著性(P＜0.05)。

2.2 EGCG對CAT活性的影響10 μmol·L-1亞硫酸鹽降低了CAT活性至對照的69%(P＜0.05)。之后，心肌細胞用不同濃度的EGCG處理后，當EGCG濃度為30 mg·L-1時，CAT的活性僅僅被抑制了41%，該數值與亞硫酸鹽單獨作用比較差異有顯著性(P＜0.05)，而當EGCG的處理濃度為50 mg·L-1，亞硫酸鹽則未能抑制CAT的活性，即與對照相比差異無顯著性(P＞0.05)，CAT活性為(1.09±0.48)U·mg-1Pro，為對照的76%，但與亞硫酸鹽單獨作用比較則差異有顯著性(P＜0.01)。

2.3 EGCG對 GPx活性的影響GPx活性在10 μmol·L-1亞硫酸鹽處理后與對照相比降低(P＜0.01)。然而，GPx活性隨著EGCG濃度的增加而提高。在EGCG 30 mg·L-1時，GPx活性為對照的67%。在EGCG 50 mg·L-1處理中，GPx活性為26 U·ml-1，是對照的84%，但與亞硫酸鹽單獨作用比較，差異有顯著性(P＞0.05)。

亞硫酸鹽處理后，OH·和H2O2的累積量不斷增加，分別為對照的1.53，1.40和2.13倍(P＜0.01)。在用EGCG處理后，亞硫酸鹽誘導產生自由基受到抑制。在30 mg·L-1EGCG處理中，僅僅H2O2水平與對照相比仍有提高，而和 OH·的含量與對照相比無統計學意義。然而，所有結果與亞硫酸鹽單獨作用比較差異都有顯著性(P＜0.05 or 0.01)，表明了EGCG抑制了亞硫酸鹽誘導的自由基的產生。

3 討論

亞硫酸鹽可能通過食物、飲料和藥物等進入體內，誘導產生含硫的自由基或過氧自由基，對各種器官及組織包括心臟造成一定的氧化損傷［6-7］。低濃度的EGCG就能起到抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤及抗癌作用，且對正常細胞的功能無明顯的抑制作用。本研究主要探討了EGCG對心血管系統的保護是否是通過抗氧化途徑完成的。本研究結果表明，亞硫酸鹽抑制了SOD，CAT和GPx的活性。當加入不同濃度的EGCG時，3種抗氧化酶的活性隨著其濃度的增加而回升。為了證明以上結論，本研究測定了心肌細胞內的自由基水平，結果發現亞硫酸鹽誘導了自由基的產生，而EGCG則抑制了這一作用。當EGCG濃度為30 mg·L-1時，亞硫酸鹽的誘導作用不再明顯。研究表明，EGCG的水溶液能夠抑制脂質過氧化，清除體內的H2O2和自由基［8］，本研究結果與該觀點是一致的。

綜上所述，EGCG溶于水清除了體內過多的活性氧自由基保護了多種抗氧化酶，對亞硫酸鹽誘導的心肌細胞的氧化損傷起到了一定的抑制作用。但有報道稱EGCG在實驗過程中存在自氧化現象，因此在今后的工作中還有待進一步研究。

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