反向遺傳操作技術在豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗研發中的應用

郭泗虎，曹宗喜，2，李海琴，閆明菲，亓文寶，焦培榮，張桂紅

（1.華南農業大學獸醫學院 農業部獸用疫苗創制重點實驗室，廣東 廣州510642；2.海南省農業科學院畜牧獸醫研究所，海南 海口571100）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起豬的一種高度傳染性疾病。該病自1987年首次發現以來，已遍及世界各個養豬國家［1］，它所引發的母豬流產和仔豬的呼吸障礙給養豬業造成了災難性的打擊。特別是2006年以來，變異株PRRSV的出現則對我國養豬業的發展產生了巨大的影響［2］。

本文從PRRSV疫苗情況、PRRSV反向遺傳系統的介紹、反向遺傳操作技術對病毒致弱作用的研究、反向遺傳操作技術在基因缺失標記疫苗的研究這4個方面就反向遺傳操作技術在PRRSV疫苗研發中的應用做一綜述。

1 PRRSV疫苗

目前普遍應用兩種商品化疫苗來預防和控制PRRSV，分別是減毒活疫苗MLV（又稱弱毒苗）和滅活苗。弱毒苗從1994年應用以來，對同源株具有有效的保護效力，但對異源株的保護作用不明顯。當前所使用的 MLV面臨許多問題［3］：疫苗株易失活，存在持續感染性，不完全的保護力及毒力返祖等。實驗性的亞單位疫苗是利用質粒、細菌、桿狀病毒、偽狂犬病病毒、腺病毒等為載體攜帶包括GP5，M和GP3等幾種抗原而發展起來的對抗PRRSV的疫苗［4］。在這些亞單位疫苗中，利用GP5串聯M或GP3的多抗原疫苗免疫動物后能產生較高的中和抗體和較強的淋巴細胞增殖反應，但這些亞單位疫苗是否比現有的MLVs或滅活苗的免疫效果好還有待于進一步驗證。

2 PRRSV反向遺傳系統

RNA 病毒的反向遺傳學研究是從病毒基因組入手研究基因的結構與功能、研究病毒的致病機理以及其他相關內容。其核心是建立病毒的感染性克隆，并通過一定的方法和途徑實現病毒的遺傳拯救，即病毒的人工構建。

目前PRRSV反向遺傳操作技術具體方法大致有兩種，第一種方法是RNA病毒基因組先經過反轉錄成為病毒cDNA，接著克隆到合適的轉錄表達載體上，克隆到轉錄啟動子下游，在體外轉錄合成病毒的基因組RNA，然后再將這些體外轉錄本轉染宿主細胞，使之在宿主細胞內包裝形成具有感染性的病毒粒子，最后從細胞培養物中回收病毒，得到感染性分子克隆。歐洲型代表株LV和北美型代表株VR－2332的全長感染性克隆的構建都是基于這種方法建立起來的［5－6］。T7或SP6啟動子插入全長病毒基因組cDNA的前端來驅動病毒的體外轉錄［6－7］。目前，這種方法已成功拯救出兩種不同基因型PRRSV，并且廣泛應用于病毒基因組功能的研究上。另一種方法是經反轉錄的cDNA克隆到表達載體上獲得具有感性的cDNA，再將該質粒轉染細胞，經細胞內轉錄生成具有感染性的病毒RNA，獲得重組病毒。Huang［8］等用該系統拯救出表達GFP的PRRSV，通過測定GFP在轉染細胞中的表達水平及拯救病毒的滴度來研究病毒的拯救效率。結果表明，與第一種方法相比，其拯救效率高10～50倍。利用改進的這種方法，繞過RNA體外轉錄這一步驟，使得研制疫苗MLV的過程大大減低了成本和節省了時間。

3 反向遺傳操作技術與病毒致弱

了解PRRSV致病機理是研制致弱疫苗的關鍵。Kwon［9］等將構建的致弱疫苗株的全長感染性cDNA克隆的特定區域與高致病性毒株的感染性cDNA克隆的同等區域進行置換，然后再分別將嵌合構建體轉染入細胞拯救出變異毒株，并接種懷孕母豬。結果顯示，NSP3－8和ORF5可能包含主要的毒力決定區，NSP1－3，NSP10－12及 ORF2等區域與毒力相關。于此類似，Wang［10－11］等利用兩株不同類型的PRRSV毒株（減毒Ingelvac PRRS MLV和MN184毒株）成功構建了嵌合的PRRSV感染性cDNA克隆，這兩種互補嵌合的cDNA克隆分別用一毒株基因組的5′－UTR／ORF1與另一株的ORF2－7／3′－UTR 融 合。以 Ingelvac PRRS MLV 株 5′－UTR／ORF1為骨架的嵌合毒組表現出與親本毒株相似的抗體反應，但與MN184組相比致病性減弱。它與以Ingelvac PRRS MLV株為骨架嵌入MN184株的ORF5－6而構建的嵌合體相似，分別能夠保護豬只免受變異株SDSU73和JA142的攻擊。此外，Gudmundsdottir［12］等用嵌合病毒在體外感染PAM來評價毒力影響因子對宿主免疫反應的影響，表明位于ORF1a區域的NSP1－8發揮著重要的調節作用。

以上結果表明，與利用細胞傳代培養而獲得減毒疫苗株的傳統方法相比，應用嵌合感染性cDNA克隆技術與野毒株基因組的ORF5－6區域進行簡單置換可以較快的致弱病毒毒力，同時，這個新的嵌合毒還能夠提高疫苗對變異株的保護效力。至于Ⅰ型和Ⅱ型PRRSV毒株之間的區域進行置換構建嵌合病毒還有待于進一步研究。

4 反向遺傳操作技術與基因缺失標記疫苗

利用血清學的檢測方法不能區分疫苗免疫豬和自然感染豬是當前弱毒苗的最大應用缺陷，而用反向遺傳操作技術對病毒基因組特定區域進行缺失，進而構建新的標記疫苗或鑒別疫苗，這在控制和最終凈化PRRSV方面具有重要價值。由于Ⅰ型和Ⅱ型PRRSV基因組的NSP2區域都能夠耐受大片段缺失，并且這些缺失區域具有一些與免疫優勢相關的 B 細胞表位［13－14］。de Lima［15－16］等將 NSP2區缺失了一處B細胞表位的PRRSV變異株免疫接種懷孕母豬，能夠誘導機體產生特異性N蛋白抗體，但不能夠產生針對缺失表位的特異性抗體，能夠利用針對缺失表位的特異性ELISA方法進行能分區疫苗免疫豬和自然感染豬，且突變毒株與親本毒表現出相類似的毒力表型。這表明NSP2區域可以作為標記性的抗原表位的缺失區域。

Kim［17］等用NSP2區缺失了免疫表位ES4表達GFP的Ⅰ型PRRSV株感染保育豬21d后，所產生的抗N蛋白抗體的水平與親本的重組病毒相似；與親本毒株相比，表達GFP的突變株毒力減弱，并表現出較輕的病毒血癥。ELISA檢測表明，接種了突變株的豬只不能夠產生對抗缺失表位的抗體，在感染14d后可以檢測到針對GFP的抗體；但重組EGFP的毒株在細胞傳代中EGFP熒光逐漸消失［18］，說明在NSP2區域引入標記位點缺乏遺傳穩定性。

Fang［18］等對氨基酸序列分析發現，ES4表位在Ⅰ型PRRSV株的NSP2序列中是高度保守的，用4株具有代表性的Ⅰ型PRRSV野毒株感染豬只后，并利用針對ES4表位的特異性ELISA方法可檢測出抗ES4抗體，這表明ES4表位缺失毒株可以用來作為一種PRRSV的標記疫苗，用以區別Ⅰ型PRRSV野毒株。但對Ⅰ型和Ⅰ型PRRSV基因序列進行比對后發現，ES4表位并不是保守的，因此基于Ⅰ型PRRSV ES4表位設計的區分疫苗免疫和自然感染的方法不適用于Ⅱ型PRRSV疫苗的區分。但這為將來合理設計PRRSV基因缺失疫苗及其相應的檢測方法具有借鑒意義［16，18］。

5 結語

反向遺傳操作技術不僅為研究病毒蛋白在PRRSV復制及其致病性作用方面提供了一個強有力的工具，而且在研制MLVs方面拓寬了視野，即通過對病毒基因組進行操作，旨在獲得變異致弱株來達到研制MLVs的目的。這種疫苗能夠有效的誘導體液和細胞免疫應答反應，增強了對這種疾病的保護力。與傳統的由細胞連續盲目傳代獲得的MLVs相比，這種疫苗更加安全和可靠。在研制有效的亞單位疫苗和基于反向遺傳技術MLVs方面，面臨的最主要限制還是世界范圍內PRRSV遺傳多樣性。而目前基于反向遺傳技術的疫苗大多數都是基于PRRSV的單一毒株制成的，這樣的疫苗對野毒株能否提供完全保護力仍需要進一步研究。

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