酶聯免疫法與乳及乳制品中抗生素殘留的檢測

邵輝，吳瑕，王劍飛，王鑫，

（1.黑龍江農業工程職業學院，哈爾濱 150001；2.東北農業大學黑龍江省乳品工業技術開發中心哈爾濱 150086；3.東北農業大學成棟學院，哈爾濱 150030）

酶聯免疫法與乳及乳制品中抗生素殘留的檢測

邵輝1，吳瑕2，王劍飛3，王鑫2，

（1.黑龍江農業工程職業學院，哈爾濱 150001；2.東北農業大學黑龍江省乳品工業技術開發中心哈爾濱 150086；3.東北農業大學成棟學院，哈爾濱 150030）

對酶聯免疫檢測技術（ELISA）做了介紹，并對該技術在乳及乳制品抗生素殘留檢測的應用進行了評述。闡述了該項技術在乳及乳制品抗生素殘留檢測中的應用前景。

酶聯免疫；乳及乳制品；抗生素殘留；快速檢測

0 引言

牛奶是人們的主要營養品，牛奶中若含有抗生素，對長期飲者來說無疑等于長期服用小計量的抗生素，對抗生素有過敏體制的人群引用，可引起過敏反應[1]，輕至各種皮疹，重至過敏性休克甚至危害生命[2]。從乳制品加工角度來看，原料乳中抗生素殘留會嚴重干擾發酵乳制品的生產，嚴重影響干酪、黃油、發酵乳的發酵和后期風味的形成[3]。因此，大多數國家開始對乳及乳制品抗生素殘留問題提出更高的要求，檢測技術日益趨于高技術、速測化、便攜化和易商品化發展。運用免疫學和生物工程技術所建立的酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)技術，在食品安全性檢測上表現出了獨特的優勢，在測定乳及乳制品抗生素殘留上有著廣泛的應用前景。

1 酶聯免疫檢測技術

酶聯免疫技術是20世紀60年代在免疫熒光和組織化學基礎上發展起來的新技術。1966年，以Engvall、 Perlmann和Schurs為先驅，發展了酶聯免疫測定方法，到1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附測定(ELISA)用于IgG定量測定的文章，使得1996年開始用于抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法［4］。首次將抗體上的酶標記用于兔免疫球蛋白上代替在免疫分析方法中應用的常規放射標記。ELISA靈敏度與放射免疫分析法相同。但是和放射免疫分析法不同的是其克服了放射免疫分析方法的缺點如暴露的放射性對人體健康的潛在危害及不需要用到昂貴的閃爍計數器［5，6］。

ELISA的基礎是抗原和抗體的固相化及抗原和抗體的酶標記。基本原理是：使抗原抗體結合到某固相載體的表面，并保持其免疫活性；抗原或抗體與酶結合形成酶標記抗原抗體復合物，既保持其免疫活性又保留酶的催化活性；在測定時，把受檢標本（測定其中的抗原或抗體）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應；用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標準受檢物質的量直接相關，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的靈敏度［4］。在應用中一般采用商品化的試劑盒進行測定，其特點是將抗原或抗體制成固相制劑，在與標本中抗體或抗原反應后，只需經過固相的洗滌，就可以達到抗原抗體復合物與其他物質的分離，簡化了操作步驟。完整的ELISA試劑盒包含以下組分：包被抗原或抗體的固相載體（固相吸附劑）；酶標記的抗原或抗體；酶的底物陰性和陽性對照品（定性測定），參考標準品和控制血清（定量測定）；結合物及標本的稀釋液；洗滌液；酶反應終止液。結合物即酶標記的抗原或抗體，是ELISA中最關鍵的試劑。良好的結合物既保持酶的催化活性，也保持了抗體(或抗原)的免疫活性。在ELISA中常用的酶是臘根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）和堿性磷酸酶（alkaline phoaohatase,AP）［7，8］。在少數商品ELISA試劑中，應用的酶有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。國產ELISA試劑一般都用HRP制備結合物。國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標記酶［8］。酶標記抗體的制備主要有戊二醛膠聯法和過碘酸鹽氧化兩種方法。酶結合物一般需經離子交換層析或分子篩分離純化。最常用的方法是通過Sepharose 4B或Sephadex G-200等進行膠過濾。

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。根據試劑的來源和標本的性狀及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。其中抗生素殘留中常用的是以下3種類型［4］：雙抗體夾心法；間接法；競爭法。

2 在抗生素殘留檢測中的應用

與傳統的微生物檢測法和理化方法相比，ELISA方法具有高度的準確性、特異性、食用范圍寬、檢測速度快等優點，目前已成為乳及乳制品中抗生素殘留檢測中廣泛應用的方法。大部分抗生素已經建立了ELISA測定法，如磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、四環素、青霉素、鏈霉素等。吳定等［9］以BSA為載體合成兩種不同摩爾比值（1︰13和1︰42）磺胺甲基嘧啶人工抗原，并比較其免疫原性。免疫家兔后獲得抗SMD多克隆抗體，并已建立了乳中磺胺甲基嘧啶殘留的ELISA方法，標準曲線的工作濃度為88%～118%。抗血清與磺胺甲基嘧啶和磺胺噻唑交叉反應率分別為6.0%和0.84%，而與其他磺胺類藥物無交叉反應。吳定等以BSA為載體合成摩爾比為1︰14的新諾明蛋白質免疫原，建立了乳中新諾明殘留競爭酶聯免疫吸附分析方法［10］。吳定等用2.5%戊二醛作膠聯劑，分別合成牛血清白蛋白-氨芐西林鈉抗原和卵白蛋白-氨芐西林鈉抗原，建立了快速測定乳中氨芐西林鈉含量的酶聯免疫吸附法［11］。楊紅用兔抗磺胺二甲嘧啶血清，建立了磺胺二甲嘧啶的ELISA法［12］，方法簡便快速，重現性好，檢出限度低。周斌等［13］以人工合成的氯霉素-牛血清白蛋白（CAPBSA）為包被抗原，氯霉素(Chloramphenicol,CAP)為競爭的半抗原，建立了快速定量測定CAP質量分數的間接競爭酶聯免疫試驗。

由于對乳及乳制品中抗生素殘留量需快速檢測，眾多開發商研制開發了ELISA試劑盒的形式。其基本原理［14］是將特定抗生素類群（如β-內酰胺類）作為靶子，讓固定在一定部位的特定的特定抗體或光譜受體（如微生物細胞）捕捉。大多數檢測法利用競爭性原理，使樣品內的抗生素與內置抗生素標志物競爭固定抗體或光譜受體結合，然后進行沖洗和顯色。內置抗生素標志物與固定抗體或廣譜受體形成的復合體，通過酶的作用分解可形成有色物質或發光物質。乳制品中的殘留抗生素與固定抗體或光譜受體形成的復合體，通過酶的作用分解無法形成有色物質或發光物質。通過測定色度或光度并與參比物對照，就可判斷結果呈陰性還是陽性。因為應用競爭性原理，最終的反應結果顏色越深或光度越強表示陰性，反之表示陽性。

美國Idexx實驗室生產的針對β-內酰胺類抗生素的LacTek內酰胺檢測法是一種適合在實驗室進行的檢測法，7 min就可以得出結果。檢測時將乳樣和競爭性酶示蹤物加入涂有固定抗體的試管中，在室溫下振蕩，使牛奶中抗生素與酶示蹤物競爭與固體抗體結合，然后將試管用沖洗液沖洗，隨后加入顯色劑，顯色結果用分光光度計檢測。如果乳樣中有抗生素殘留，則會搶占酶示蹤物的結合位點，使酶示蹤物在沖洗時被洗掉，加入顯色劑后，形成色度較淺或并無顯色現象。該實驗室開發的SNAP檢測法，由一個試管和一個裝有試劑的一次性塑料裝置組成，它利用毛細管現象拖拽乳樣和酶示蹤物試劑通過固定抗體。10 min可得到試驗結果。

3 應用前景

目前以用于檢測乳及乳制品抗生素殘留檢測的方法主要有3種：微生物受阻法、理化檢測法、免疫學分析法。微生物受阻法雖然有了新的發展，但還存在檢測需時長，操作復雜，很難篩選達到對同類抗生素的不同藥敏性的特異菌株等缺點。理化檢測法設備昂貴，檢測費用高，需要復雜的樣品前處理，很難推廣使用。免疫分析方法中的酶聯免疫吸附分析（ELISA）是目前絕大多數試劑盒采用的方法，準確度高，特異性強，快速便捷，但檢測費用很高，受到對主要設備的要求以及供貨連續性等因素的影響。這些方法雖然各有缺點和局限性，相比之下，在實際中只有應用ELISA檢測技術才能最大程度上滿足乳及乳制品抗生素殘留快速檢測所需求的條件。隨著一些基礎研究的進展以及用于食品分析的ELISA試劑盒的大量生產，使ELISA方法的優勢更加明顯，更加符合食品分析要求的準確、快速、簡便易操作，因此可以預言在未來的乳及乳制品抗生素殘留檢測中，ELISA將會成為很重要的一個技術手段，并將引起世界各國的廣泛重視和深入研究。

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Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and detection of antibiotics residues in milk and milk products

SHAO Hui1,WU Xia2,WANG Jian-fei3,WANG Xin2
（1.Heilongjiang Agriculture Project Profession clooege，Harbin 150001，China;2.Heilongjiang Dairy Industrial and Technical Reseearch Center,Northeast Agricultural University,Harbin 150086,China；3.Chengdong College of Northeast Agriculture University,Harbin 150030,China)

In this paper,the technology of Enzyme-linked Immunosorbent Assay(ELISA)was introduced first.Meanwhile,the application of ELISA in the detection of antibiotics residues in milk and milk products was commented.Finally the prospect of ELISA in the detection of antibiotics residues in milk and milk products was also forward promoted.

ELISA;milk and milk products;antibiotics residues;rapid detection

TS252.7

B

1001-2230（2011）06-0058-02

2010-12-22

邵輝（1977-），女，工程師，研究方向為畜產品加工。