塞來昔布對宮頸癌HeLa細胞的放射增敏作用觀察及機制探討

王愛紅,余娟娟,戚世芳,田曉予

(河南科技大學第一附屬醫院,河南洛陽 471003)

研究發現,選擇性環氧合酶2(COX-2)抑制劑不僅具有抗腫瘤活性,且對腫瘤具有放射增敏效應,但其放射增敏機制尚不清楚。2009年 6月 ～2010年 8月,我們觀察了COX-2抑制劑塞來昔布對宮頸癌HeLa細胞的放射增敏作用,并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與試劑 塞來昔布,HeLa細胞,血管內皮生長因子(VEGF-C)抗體、SP試劑盒和DAB顯色試劑盒,RPMI 1640,胰蛋白酶,胎牛血清。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HeLa細胞培養于含10%小牛血清的RPMI 1640培養基中,置37℃5%CO2恒溫箱中培養,每天換液、觀察細胞,3 d傳代1次。

1.2.2 HeLa細胞放射敏感性測定 采用克隆形成實驗。取對數生長期的HeLa細胞,以1×104/ml的細胞密度接種 6孔板,培養 24 h后分為 3組。陰性對照組單純用培養液培養;單純放射組設不同照射劑量(2、4、6、8Gy)亞組,照射采用6MV的X線,劑量率2 Gy/min,培養瓶表面覆蓋1.5 cm有機玻璃板,源皮距100 cm;放射加藥組先用20、40μmol/L塞來昔布作用72 h,再行2、4、6、8 Gy照射。根據不同照射劑量(0、2、4、6、8 Gy),接種 100、150、350、700、3 500個細胞到 6孔板(每劑量點設 3個平行孔)培養12 d,4%多聚甲醛固定30 min,結晶紫染色,低倍鏡下計數 ＞50個細胞的克隆數,實驗重復 3次。克隆形成率(PE)=集落數/接種細胞數× 100%,存活分數(SF)=某一劑量照射組的集落數/ (該組細胞接種數 ×未照射組克隆形成率)。以多靶單擊模型擬合細胞存活曲線,計算細胞放射敏感性參數平均致死劑量(Do)、準域劑量(Dq)、2 Gy照射的存活分數(SF2)以及放射增敏比(SERDo)。

1.2.3 COX-2、VEGF-C蛋白檢測方法 取對數生長期HeLa細胞,以1×104/m l滴加于6孔板內處理好的蓋玻片上,培養 24 h后分成 3組。陰性對照組單純培養液培養,單純放射組采用 2 Gy照射,放射加藥組先用40μmol/L塞來昔布作用72 h,再行2 Gy照射。以4%多聚甲醛常溫固定細胞30 min,用兩步法進行免疫細胞化學染色。COX-2、VEGF-C蛋白陽性細胞為胞質內呈現黃色或棕黃色顆粒,于400×顯微鏡下,每張切片計數 10個視野,以陽性細胞百分比代表蛋白表達量。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS17.0軟件。組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組HeLa細胞放射敏感性比較 見表1。

表1 各組HeLa細胞放射敏感性比較(±s)

表1 各組HeLa細胞放射敏感性比較(±s)

注:與單純放射組比較,＊P＜0.05;與放射加藥組20μmol/L比較,#P＜0.05

組別 Do Dq SF2 SERDo單純放射組 3.45±0.08 2.20±0.06 0.78±0.16 —放射加藥組20μmol/L 1.70±0.07＊ 1.90±0.05＊0.60±0.03＊ 2.01±0.06 40μmol/L 1.40±0.07＊# 0.19±0.02＊#0.24±0.01＊# 2.41±0.08

2.2 HeLa細胞中的COX-2、VEGF-C蛋白表達比較見表2。

表2 HeLa細胞中的COX-2、VEGF-C蛋白表達比較(%,±s)

表2 HeLa細胞中的COX-2、VEGF-C蛋白表達比較(%,±s)

注:與對照組比較,＊P＜0.05;與單純放射組比較,#P＜0.05

組別 COX-2 VEGF-C陰性對照組 50.43±0.78 58.63±1.55單純放射組 91.43±1.70＊ 93.5±0.78＊放射加藥組 11.73±1.42＊# 9.03±1.16＊#

3 討論

塞來昔布是一種特異性COX-2抑制劑。Harris等首次發現,塞來昔布具有預防乳腺癌發生的作用。隨后發現[1,2],其對胃癌、結腸癌、膽管癌等消化系統腫瘤和白血病、膀胱癌等非消化系統腫瘤細胞均有較好的生長抑制和促凋亡作用。本研究結果顯示,放射加藥組Do、Dq和SF2值均小于單純放療組;其SERDo由2.01±0.06增至2.41±0.08,提示塞來昔布對HeLa細胞的放療增敏效應,且具有濃度依賴性。

VEGF-C是VEGF的一種新同源物,是迄今發現最具特異性的淋巴管內皮生長刺激因子;VEGF-C能調節腫瘤血管新生以及淋巴管生成,促進腫瘤細胞生長和抑制凋亡;在與其受體VEGFR-3結合后,通過MEK/ERK和PI3激酶/Akt途徑引起淋巴管內皮細胞增生[3],為腫瘤的淋巴轉移提供機會。近年來,在多種腫瘤中均發現COX-2表達與VEGF-C表達具有相關性,并可影響腫瘤的淋巴結轉移。王玲等[4]在其研究中發現,塞來昔布可阻斷乳腺癌細胞中的NF-κB信號通路,而VEGF-C基因的上游啟動子中有明確的 NF-κB結合位點。Su等[5]在人肺腺癌細胞中發現,COX-2表達可激活HER2/Neu酪氨酸激酶受體,并通過 EP-1受體依賴途徑,上調VEGF-C基因表達,進而影響腫瘤淋巴管生成和淋巴結轉移。COX-2參與了細胞VEGF表達的調控, PGE2為該過程的主要介質[6]。COX-2可能通過增加PGs和VEGF加速腫瘤生長[7]。本研究結果顯示,塞來昔布可抑制COX-2、VEGF-C表達,提示抑制COX-2、VEGF-C表達可能是其抑制腫瘤細胞增殖及放療增敏作用的分子機制之一。

[1]冉俊濤,周永寧,唐承薇,等.塞來昔布誘導人胃癌細胞凋亡控制新生血管形成[J].中華腫瘤雜志,2008,30(6):448-451.

[2]Muller AC,Handtrick R,Elsaesser SJ,et al.Importance of Bak for celecoib-induced apoptosis[J].Biochem Pharmacol,2008,76(9):1082-1096.

[3]Am ioka T,Kitadai Y,Tanaka S,et al.VEGF-C expression predicts lymph nodemetastasisofhuman gastric carcinomas invading the submucosa[J].Eur JCancer,2002,38(10):1413-1419.

[4]王玲,張奇,趙博,等.塞來昔布通過阻斷NF-κB信號通路誘導人乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞周期阻滯的相關研究[J].中國癌癥雜志,2009,19(1):33-39.

[5]Su JL,Shih JY,Yeng YM,etal.Cyclooxygenase-2 induces EP1-and HER-2/Neu-dependent vascular endothelial growth factor-C up-regulation:a novelmechanism of lymphangiogenesis in lung adenocarcinoma[J].Cancer Res,2004,64(2):554-564.

[6]Toomey DP,Murphy JF,Conlon KC.COX-2,VEGF and tumour angiogenesis.[J].Surgeon,2009,7(3):174-180.

[7]Dai Y,Zhang X,Peng Y,et al.The expression of cyclooxygenase-2, VEGF and PGs in CIN and cervical carcinoma[J].Gynecol Oncol, 2005,97(1):96-103.