宮頸癌組織中法尼基轉移酶 β-亞單位基因的表達變化及意義

朱英宏,羅 兵

(1萊蕪市人民醫院,山東萊蕪 271100;2青島大學醫學院附屬醫院)

宮頸癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤,病死率居女性癌癥病死率的第 2位。法尼基轉移酶(FTase)是一種位于細胞溶質中的酶,廣泛分布于哺乳動物細胞、酵母及卵蛙細胞中,催化細胞多肽翻譯后修飾的第一步驟,即法尼基化。其底物包括Ras蛋白、核纖層蛋白、視紫紅質激酶、磷酰化酶激酶等[1]。FTaseβ亞單位可結合Ras蛋白[2]。Ras蛋白的生物活性與法尼基化修飾有密切關系。2005年9月～2008年7月,我們采用RT-PCR技術檢測了宮頸癌組織中的FTaseβ亞單位mRNA,探討其在宮頸癌診斷和預后判斷中的作用和價值,為FTase抑制劑用于宮頸癌的治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 宮頸癌 45例,年齡 27～72歲,平均42.5歲;其中TNM分期Ⅰ期23例,Ⅱ期22例;中分化 26例,低分化 19例;有淋巴結轉移 9例,無淋巴結轉移 36例。均行腫瘤切除術,留取癌組織標本;均經病理學確診,術前均未行放療、化療或激素治療。同時,選取 20例同期因子宮肌瘤行子宮全切術后的正常子宮頸組織作為對照。

1.2 FTaseβ亞單位mRNA檢測方法 采用RTPCR法。先用Trizol試劑提取癌組織總RNA,每例取總RNA 2μl,用AMV反轉錄酶行反轉錄;以反轉錄所得cDNA作為PCR反應的模板,擴增FTaseβ亞單位基因和內參照GADPH基因。FTaseβ亞單位mRNA引物參照文獻[3]設計,由上海生工合成。PCR反應體積為25μl,包括FTaseβ亞單位mRNA和內參照基因GAPDH上下游引物均0.3μmol/L, Taq DNA聚合酶1.0 U,cDNA模板2μl,加雙蒸水至終體積25μl。PCR擴增參數為94℃預變性5 min;然后94℃40 s,56℃40 s,72℃1min,共擴增35個循環;最后 72℃延伸10 min。結果判定:取PCR擴增產物5μl于含溴化乙錠(0.5 mg/L)的2%瓊脂糖凝膠中電泳,80 V 1 h,紫外投射儀下觀察結果并拍照,與DNA分子量Marker對照相比,出現316 bp和450 bp擴增條帶表明擴增成功。采用凝膠圖像分析系統對FTaseβ亞單位mRNA的表達進行半定量分析,以FTaseβ亞單位與GAPDH的比值表示目的基因的表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件。數據比較采用t檢驗及方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

宮頸癌組織中FTaseβ亞單位mRNA表達水平為1.065 8±0.630 8,正常宮頸組織中為0.763 2± 0.190 9,兩者比較,P＜0.05;FTaseβ亞單位mRNA表達水平與宮頸癌臨床病理參數的關系見表 1。由表1可見,FTaseβ亞單位mRNA表達水平與宮頸癌分化程度有關(P＜0.05)。

3 討論

宮頸癌的病因至今尚未完全明了。一般認為,宮頸癌發病與早婚、性生活紊亂、性生活過早、早年分娩、密產、多產、經濟狀況、種族和地理環境等因素有關,病毒感染也是宮頸癌發病的重要危險因素。研究表明,約30%的人類腫瘤存在Ras基因突變、Ras蛋白表達水平增高的現象。FTase是近年來發現的與Ras蛋白異戊二烯化修飾密切相關的一種必需酶。抑制FTase的活性,可以阻止Ras蛋白法尼基化,有效的抑制腫瘤細胞的增殖。近年來,Ras蛋白、FTase與女性生殖系統腫瘤關系的研究也取得了一定進展。

表1 FTaseβ亞單位mRNA表達水平與宮頸癌臨床病理參數的關系

Ras蛋白合成后,需經一系列加工修飾方可定位于細胞膜內側,進而實行其信號轉導功能,法尼基化是 Ras蛋白脂化修飾的最關鍵步驟之一[4.5]。FTase可將膽固醇合成途徑中的中間體法尼基焦磷酸(FDP)的法尼基轉移到Ras蛋白C-末端的半胱氨酸上,Ras蛋白首先在細胞質的游離核糖體中合成前體蛋白(pro-p21),經過一系列翻譯后的C端修飾,增強了蛋白的疏水性使之定位于質膜的內表面。FTase是由 α、β兩種亞單位組成的異二聚體,β-亞單位識別底物序列,結合Ras蛋白;α-亞單位是其底物法尼基二磷酸鹽FPP的攜帶者,FTase的酶催化功能必須由 α、β亞單位共同完成,任何一個亞單位的變性都會影響酶活性。

FTase通過催化Ras蛋白法尼基化,由Ras蛋白作為信號傳導開關引起一系列細胞信號傳導;為探討FTase是否直接參與細胞增殖,Nagase等[6]采用DNA重組技術將FTaseα和FTaseβ亞單位編碼基因同時轉染NIH3T3細胞,對FTase過表達細胞中Ras蛋白的法尼基化以及Ras信號轉導途徑的上下游因子活性進行了研究。結果顯示,轉染細胞呈FTase過表達,α、β亞單位蛋白表達較未轉染細胞提高3～13倍,FTase活性提高1.5～3倍,法尼基化Ras蛋白表達增加。Nagase等進一步研究發現,合適劑量的生長因子能明顯提高FTase過表達細胞的DNA合成和細胞增殖。Nagase將FTase過表達細胞注入無胸腺裸鼠可導致腫瘤形成,但該類腫瘤與將Ras過表達細胞注入裸鼠形成的腫瘤表型明顯不同,提示FTase直接參與細胞生長轉化以及腫瘤形成機制。

本研究結果顯示,宮頸癌組織中FTaseβ亞單位mRNA明顯高于正常宮頸組織,且其表達水平與宮頸癌分化程度明顯相關,我們認為FTase可能直接參與宮頸細胞的癌變過程,其水平可作為宮頸癌診斷和預后判斷的重要指標。

[1]Clarke S.Protein isoprenylation and methylation at carboxylterm inal cysteine residues[J].Annu Rev Biochem,1992,(61):355-386.

[2]Reiss Y,Seabra MC,Armstrong SA,et al.Nonidentical subunits of p21H-ras farnesyltransferase.Peptide binding and farnesyl pyrophosphate carrier functions[J].JBiol Chem,1991,266(5):10672-10677.

[3]Khan SG,Dummer R,Siddiqui J,et al.Farnesyltransferase activity and mRNA expression in human skin basal cellcarcinomas[J].Biochem Biophys Res Commun,1996,220(3):795-801.

[4]朝宇,許根俊.Ras的結構和功能及其參與的信號傳導[J].生物化學與生物物理進展,1995,22(6):482-486.

[5]Rowinsky K,Jolene JW,Daniel D,et al.Ras protein farnesyltransferase:a strategic target for anticancer[J].J Clin Oncol,1999,17 (11):3631-3652.

[6]Nagase T,Kawata S,Nakajima H,et al.Effect of farnesyltransferase over expression on cell growth and transformation[J].Int JCancer, 1999,80(3):126-133.