PCR-SSP法在強(qiáng)直性脊椎炎患者中HLA-B27的診斷作用

周建月,田曉豐（.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科,廣西南寧 53002;2.吉林大學(xué)普外科中心,吉林長春 3004）

*通訊作者

HLA-B27是人類白細(xì)胞抗原B位點(diǎn)上的一個重要的等位基因,與脊椎關(guān)節(jié)系統(tǒng)疾病如強(qiáng)直性脊柱炎（AS）、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎（ReA）、Reiter氏綜合征（RS）等許多嚴(yán)重危害人類健康的疾病密切相關(guān)。HLAB27的檢測有血清學(xué)檢測和PCR技術(shù)檢測兩種,我們對疑為強(qiáng)直性脊椎炎患者的HLA-B27進(jìn)行了兩種方法的檢測,報告如下。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 36例廣西省各醫(yī)院可疑強(qiáng)直性脊椎炎患者標(biāo)本。

1.2 HLA-B27血清學(xué)分型 取患者EDTA抗凝全血3.5ml,其中3 m l用于微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)檢查HLA-B27抗原,預(yù)留0.5m l用于DNA的提取。檢定血清板含有陽性對照、陰性對照及4份抗B27血清。

1.3 HLA-B27 PCR-SSP基因檢測

1.3.1 制備DNA模板 用預(yù)留的0.5 ml全血采用快速鹽析法提取DNA,5μl純凈水溶解。

1.3.2 HLA-B27 PCR引物設(shè)計根據(jù)HLA-B27基因序列設(shè)計引物為5'-CAGTCTGTGCCTTGGCGTTGC-3';5'-GGCTACGTGGACGACACGCT-3',PCR產(chǎn)物為144 bp。內(nèi)對照為人類生長激素（HGH）基因特異性引物,HGH-A鏈引物序列為:5'-TGCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3',HGH-B鏈引物序列為:5'-CCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物為434 bp。

1.3.3 PCR擴(kuò)增體系為50μl:DNA Taq酶0.5u,10×PCR buffer 5μl,dNTP:1mM,每條引物終濃度 1μM和DNA 2μg;循環(huán)參數(shù)為 94℃,5 min;94℃,30 s;60℃,30 s;72℃,50 s;30個循環(huán)后72℃,5 min結(jié)束擴(kuò)增后2%瓊脂糖電泳30 min后,凝膠成像記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測結(jié)果 36份標(biāo)本血清學(xué)檢測出17份HLA-B27抗原陽性,14份HLA-B27抗原陰性,5份血清學(xué)結(jié)果可疑。

2.2 PCR檢測結(jié)果 有美國G&T提供4份含有HLA-B27基因的DNA標(biāo)準(zhǔn)品和4份無HLA-B27基因的DNA標(biāo)準(zhǔn)品作為擴(kuò)增判定標(biāo)準(zhǔn)。檢測有HLAB27基因的,出現(xiàn)434 bp內(nèi)對照帶和144 bp特異性帶。檢測沒有含有HLA-B27基因的,僅出現(xiàn)434 bp內(nèi)對照帶,不出現(xiàn)144 bp特異性帶。同次擴(kuò)增DNA標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果正確無誤。36份標(biāo)本均重復(fù)2次,檢測結(jié)果一致。如圖1所示。

2.3 PCR檢測結(jié)果中20例有HLA-B27基因,其中17例是血清檢測陽性結(jié)果樣本,另3例是血清學(xué)檢測結(jié)果可疑樣本。16例無HLA-B27基因,其中14例是血清檢測陰性結(jié)果樣本,另2例是血清學(xué)檢測結(jié)果可疑樣本。

圖1 HLA-B27 PCR擴(kuò)增結(jié)果示意圖

2.4 本試驗(yàn)36例樣本 以PCR-SSP技術(shù)檢測有HLA-B27基因者20例,其中19例樣本達(dá)到AS臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),1例不能確診為AS。

3 結(jié)論

AS是一種主要侵犯脊柱并可不同程度累及骶髂關(guān)節(jié)和周圍關(guān)節(jié)的慢性進(jìn)行性炎性疾病,HLAB27抗原與AS具強(qiáng)相關(guān)性[1],HLA-B27陽性在AS的診斷中具有較高的價值。廖艷秋[2]等認(rèn)為,如果病人診斷AS的可能性為50%,若病人B27陽性,則診斷AS的概率提高到95%左右,若該患者B27陰性,則患AS的概率降至3%左右。所以能否正確判定HLA-B27抗原對于診斷非常重要。采用血清學(xué)檢測的缺點(diǎn)是:要求新鮮血至少3ml及足夠量的活淋巴細(xì)胞。難以獲得強(qiáng)度為100%的HLA-B27單抗血清,不同廠家的抗血清質(zhì)量難以統(tǒng)一,不同批號之間存在亞型特異性等諸多問題。幾份血清血檢測結(jié)果不一致時難以下結(jié)論,對于這樣的可疑樣本人為主觀判斷因素影響大。而PCR檢測技術(shù)對樣本要求不高,血樣或提取的DNA均可長期保存,便于重復(fù)檢測。PCR操作簡便、結(jié)果可靠,準(zhǔn)確性和重復(fù)性強(qiáng)。對于HLA-B27的檢測用PCR方法優(yōu)于血清學(xué)方法。

[1][1]Mcmichel A,Bell J.HLA-B27:a disease-associated immune response gene[J].Res Immunol,1991,142:475.

[2]廖艷秋,陶良軍,王紅梅,等.HLA-B27的檢測極其臨床意義的探討[J].中國輸血雜志,2001,14（6）:373.