柴胡解毒注射液體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒試驗

吳金梅,江青東,胡迎利

(鄭州牧業工程高等專科學校動物醫學系,河南鄭州 450011)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由PRRSV引起的豬的一種高度傳染性疾病。其主要癥狀表現為妊娠母豬的流產、死胎等繁殖障礙等。該病自1987年首次被發現以來,現在已遍及世界各個養豬國家,它所引發的病變給養豬業造成了災難性的打擊。我國已先后在北京、上海、浙江等地分離到該病毒,血清學調查陽性率為80%[1-3]。近年來,湖北、河南、福建等地也相繼報道了本病的發生和流行[4-5]。目前用于預防PRRS主要是滅活苗和弱毒苗,滅活苗的效果不穩定,經常導致免疫失敗[6-7];弱毒苗存在毒力返強的危險,而且有可能傳播疫苗毒[8-10]。

許多中草藥被研究證實具有增強免疫力、抑制和殺滅病原微生物的作用,柴胡解毒注射液是由柴胡、板藍根、地黃、黃芩、梔子、連翹、玄參 7味藥組成,具清熱安胎、瀉火解毒、疏肝健脾、清心熱等功效,本試驗以柴胡解毒注射液為試驗藥物,在體外細胞水平上進行抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒作用研究,為獸醫臨床用藥提供試驗依據,同時也為開發中藥柴胡解毒注射液提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞株 PRRSV標準毒株ATCCVR-2322株、標準陽性血清和Marc-145細胞來源于美國。

1.2 藥物、試劑和培養基 柴胡解毒注射液由本單位自制,含量為1 g/m L。利巴韋林注射液由上海哈森藥業公司提供,含量為 0.1 g/m L。培養基為DMEM+10%FBS。

1.3 柴胡解毒注射液的制備

1.3.1 處方 柴胡450 g、板藍根400 g、地黃300 g、黃芩450 g、梔子500 g、連翹400 g、玄參300 g。

1.3.2 制備方法 將柴胡按處方量,加4倍量水,80℃溫浸 20 h,經水蒸氣蒸餾收集初餾液 1 500 m L,重蒸餾,收集蒸餾液500m L,加丙二醇50m L,振搖,備用。柴胡藥渣與黃芩、板藍根、地黃、梔子、連翹、玄參按處方量,加6倍量水煎煮2次,每次2 h,合并煎液,濃縮至相對密度為1.10(80℃熱測),加75%乙醇,攪拌,4℃冷藏24 h,濾過,回收乙醇至無醇味,得醇沉提取液;備用液與醇沉提取液合并,靜置24 h,過濾濃縮至相對密度為1.12(常溫),加水至2 000 m L,調pH 值7.0,濾過,灌封,滅菌,即得柴胡解毒注射液。

1.4 柴胡解毒注射液對Marc-145細胞最大安全濃度的測定 將Marc-145細胞接種于96孔細胞培養板上,培養24 h形成致密單層,棄上清。分別將柴胡解毒注射液、0.1 g/m L利巴韋林注射液用DMEM維持液先作10倍稀釋,然后再作連續2倍比稀釋,分別作12個稀釋濃度,即柴胡解毒注射液稀釋濃度為:112 、56 、28 、14 、7、3.5 、1.75、0.875、0.437 5 、0.218 8、0.109 4 、0.055m g/m L;利巴韋林注射液稀釋濃度為:10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 、0.078 、0.039、0.019 5、0.009 75、0.004 9 mg/m L。將各稀釋度溶液加到已長有單層Marc-145細胞的96孔細胞培養板上,每個稀釋度重復4孔,每孔100μL。另以DMEM細胞維持液代替藥液作為正常細胞對照,置37℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養24 h后連續3 d觀察細胞病變情況。最后根據細胞病變判定藥物對細胞的毒性,以不出現細胞病變的最大藥物濃度為最大安全濃度。

1.5 PRRSV標準毒株 TCID50的測定 將Marc-145細胞接種于96孔細胞培養板上,培養24 h形成致密細胞單層,棄上清。將PRRSV標準毒株作連續10倍比稀釋成6個濃度,加到96孔細胞培養板上,每個稀釋度重復6孔,每孔100μL,其他均設為細胞對照組,置37℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養。72h后用倒置顯微鏡觀察細胞病變情況,記錄產生的細胞病變(CPE),直至病毒最高稀釋度不再產生新病變為止。根據 Reed-Muench公式,計算PRRSV的半數細胞感染量(TCID50)。

1.6 柴胡解毒注射液對PRRSV的體外作用試驗

1.6.1 柴胡解毒注射液在細胞水平上對PRRSV抑制作用測定 將Marc-145細胞接種于96孔細胞培養板上,培養24 h形成致密細胞單層,棄上清。先將柴胡解毒注射液、利巴韋林注射液從最大安全濃度作連續2倍比稀釋,加入96孔細胞培養板上,每孔100μL,置于37℃2 h;再將含有100×TCID50的病毒液加到上述已加入藥物的細胞孔內,每個稀釋度重復4孔,每孔100μL。均設立正常細胞對照及病毒對照,置37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。24 h后連續4 d觀察病變情況。

1.6.2 柴胡解毒注射液在細胞水平上對PRRSV殺滅作用測定 將Marc-145細胞接種于96孔細胞培養板上,培養24 h形成致密細胞單層,棄上清。將柴胡解毒注射液、利巴韋林溶液從最大安全濃度作2倍比稀釋,加入等量200×TCID50病毒液,混勻后置于37℃孵育2 h,加入96孔細胞培養板中,每個稀釋度重復4孔,每孔100μL。均設立正常細胞對照及病毒對照,置37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。24 h后連續4 d觀察病變情況。

1.6.3 柴胡解毒注射液在細胞水平上對PRRSV阻斷作用測定 將Marc-145細胞接種于96孔細胞培養板上,培養24 h形成致密細胞單層,棄上清。先將含有100×TCID50的病毒液加到96孔細胞培養板中,每孔 100μL,置于 37℃作用 2 h后,棄上清。再將柴胡解毒、利巴韋林注射液從最大安全濃度作2倍比稀釋,加到上述已感染病毒的細胞孔內,每個稀釋度重復4孔,每孔100μL。均設立正常細胞對照及病毒對照,置37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。24 h后連續4 d觀察細胞病變情況。

1.7 細胞病變判斷標準 以“+”號表示細胞發生病變的百分數,25%以下表示為CPE(+),26%～50%表示為CPE(++),51%～75%表示為CPE(+++),76%～100%表示為 CPE(++++)。細胞對照形態均正常,表示為CPE(一),病毒對照都產生病變,表示為CPE(++++)。

2 結果與分析

2.1 柴胡解毒注射液對Marc-145細胞最大安全濃度的測定結果 見表1。

由表1可知,(1)柴胡解毒注射液在Marc-145細胞上最大安全濃度為7 000μg/m L。(2)利巴韋林注射液最大安全濃度為39μg/m L。

表1 柴胡解毒注射液最大安全濃度測定結果

2.2 PRRSV的 TCID50的測定結果 根據 Reed-Muench公式,計算得到PRRSV在Marc-145細胞的 TCID50為105.5/0.1 m L。

2.3 試驗結果 見表2、表3和表4。

表2 柴胡解毒注射液對PRRSV抑制作用結果

表3 柴胡解毒注射液對PRRSV殺滅結果

由表2可知:柴胡解毒注射液對PRRSV的有一定的抑制作用,在55～7 000μg/m L范圍內作用顯著;利巴韋林對PRRSV的抑制效果較顯著,且明顯強于柴胡解毒注射液。

由表3可知:柴胡解毒注射液和利巴韋林都對PRRSV有較好的殺滅效果。

表4 柴胡解毒注射液對PRRSV阻斷作用結果

由表4可知:柴胡解毒注射液對PRRSV的有阻斷作用,在220～7 000μg/m L范圍內作用顯著;利巴韋林對PRRSV有較好的阻斷效果。

3 討論

本試驗用柴胡解毒注射液,以PRRSV為試驗對象,從量的水平上以微量細胞培養法進行柴胡解毒注射液的抗病毒作用試驗。試驗中同時設立陰性和陽性對照,在同一塊96孔細胞培養板中進行,所有條件一致,因此所得的結果可信,具有良好的可比性。另外用利巴韋林注射液這種抗病毒藥作為對照藥,使試驗結果可比性高。

本試驗設計3種加藥方式,結果顯示,第2組中藥樣品對病毒的殺滅效果更為顯著。其原因可能為:第1組病毒侵染細胞后添加中藥,中藥樣品對細胞內的病毒起一定的抑制作用,抑制了病毒的生物合成及成熟釋放;第2組柴胡解毒注射液可能通過體外直接滅活病毒而發揮抗病毒作用;第3組,中藥與細胞作用后,一定程度阻止了病毒的吸附和侵入,其具體作用機理有待于進一步探明。

柴胡解毒注射液由柴胡、板藍根、地黃、黃芩、梔子、連翹、玄參等7味中藥組成。本方特點是柴胡和解退熱為主藥,配之黃芩瀉肺火于前焦的同時,配伍大量的板藍根、梔子、連翹等清熱解毒藥和地黃、玄參等涼血養陰藥,氣血兩清,使熱毒迅速清除。諸藥合用從而達到標本兼治的目的。

[1] Tian K,Yu X,Zhao T,etal.Em ergence of fatalPRRSV variants:unparalleled ou tb reaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLOSONE,2007,2(6):526.

[2] Tong G Z,Zhou Y J,Hao X F,etal.High ly pathogenic porcine rep rodu ctiveand respiratory synd rom e,China[J].Emerg In fect Dis,2007,13(9):1434-1435.

[3] 付利芝,周淑蘭,王可甜.豬細小病毒診斷方法研究概況[J].四川畜牧獸醫學院學報,2001,15(4):47-50.

[4] 李明剛.湖北省豬細小病毒感染血清學調查報告[J].中國動物檢疫,1995,12(1):123-133.

[5] 李昌文,仇華吉,童光志,等.豬細小病毒研究進展[J].動物醫學進展,2004,(1):36-38.

[6] Meng X J.H eterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus:im plications for cu rren t vaccine efficacy and futu re vaccine developm en t[J].Vet Microbiol,2000,74(4):309-329.

[7] NilubolD,PlattK B,Halbu rPG,eta l.Theeffect of akilled porcine rep roductiveand respiratory syndrome virus(PRRSV)vaccine treatm ent on virus shedding in previously PRRSV infected pigs[J].Vet Microbiol,2004,102:11-18.

[8] Madsen K G,Hansen C M,Madsen E S,et a l.Sequence analysis of po rcine reproductive and respiratory synd rom e virus of the Am erican type collected from Danish sw ine herds[J].A rch Virol,1998,143:1683-1700.

[9] Mengeling W L,Lager K M,Vorw ald A C.C linical consequencesof exposing p regnant gilts to strains of porcine rep roductive and respirato ry syndrome(PRRS)virus isolated from field cases of atypical PRRS[J].Am JVet Res,1998,59:1540-1544.

[10]Key K F,Guenette D K,Yoon K J,eta l.Development of a H eteroduplex Mobility Assay To Identify Field Isolatesof Porcine Reprodu ctive and Respiratory Syndrome V irus with Nucleotide Sequences Closely Related to Those of Modified Live-A ttenuated Vaccines[J].J C lin Microbiol,2003,41(6):2433-2439.