牛奶中頭孢噻呋殘留消除規律及棄奶期試驗

張玉潔,仲 鋒,李 丹,李 倩,汪 霞,黃耀凌,何 燕,薛 毅

(1.中國獸醫藥品監察所,北京海淀 100081;2.華南農業大學獸醫學院,廣東 廣州 510642;3.中國動物疫病預防控制中心,北京朝陽 100026）

頭孢噻呋(Ceftiofur）,其分子式為C19H17N5O7S3,化學名為[6R-[6α,7β(z）]]7-[[(α-氨基-4-噻唑基）(甲氧亞氨基）乙酰]氨基]-3-[[(2-呋喃羰基）硫代]甲基]-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環[4,2,0]辛-2-烯-2-羧酸。該藥是由Bernardlabeeuw 等人于1984年首次合成,其后美國法瑪西亞-普強公司(Pharmacia&Upjohn）將其研制成鈉鹽的凍干粉及鹽酸鹽的混懸液,用于動物疾病的治療。1988年,美國藥品與食品管理局(FDA）批準頭孢噻呋鈉用于治療牛呼吸道細菌性疾病。由于其優良的抗菌活性和藥動學特點,陸續被美國、加拿大、日本及歐洲一些國家正式批準用于肉牛、奶牛、馬、豬、羊的呼吸道疾病的治療[1-2]。

目前,國內外對于頭孢噻呋在各種動物體內的藥物代謝動力學研究已有廣泛報道[3-10],試驗證明,頭孢噻呋安全范圍大,體內殘留量低,FDA已確定其無宰前停藥期和牛奶棄奶期。

國內該藥物在牛奶中殘留消除規律的報道不多,本文通過對牛用頭孢噻呋晶體注射液在牛奶中的殘留消除規律以及棄奶期的確定進行試驗,旨在為該藥物在我國的正確使用提供科學參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 北京市滄達農工商有限公司奶牛場6頭健康荷斯坦系黑白花泌乳期奶牛。年齡2.5～8歲,體重450kg左右。試驗前未使用過頭孢噻呋。

1.2 試驗動物用藥 頭孢噻呋晶體注射液(牛用）100mL:20g;批號:LotOA4AK;輝瑞國際貿易(上海）有限公司提供。

1.3 儀器與試劑 Agilent1100高效液相色譜儀(配紫外檢測器和二元梯度洗脫系統）;SPE柱:BondElutC18,1g/6mL;BondElutSCX100mg/10mL;恒溫水浴振蕩器;固相萃取裝置;pH值計;冷凍離心機。

頭孢噻呋標準品(中國獸醫藥品監察所 以C19H17N5O7S3計,含量 87.5%）、乙腈(色譜純）、甲醇(色譜純）、二硫赤蘚醇(DTE）(含量 99%）、碘乙酰胺(含量97%）、冰醋酸、氫氧化鈉、醋酸銨、三氟乙酸(TFA）(含量99%）、超純水。

1.4 溶液配制 頭孢噻呋標準液(5.0g/mL）:量取0.5mL頭孢噻呋標準儲備液(1mg/mL）,于10 mL容量瓶中,用0.1mol/L醋酸銨緩沖液溶解并稀釋至刻度。

醋酸銨溶液1.0mol/L:稱取77.1g醋酸銨,加水溶解并稀釋至1000mL。

醋酸銨溶液0.1mol/L:稱取7.71g醋酸銨,加水溶解并稀釋至1000mL。

NaOH 溶液1.0mol/L:取NaOH40g,加水溶解并稀釋至1000mL。

2%醋酸溶液:取20mL醋酸,加水溶解并稀釋至1000mL。

DTE提取液:20mg/mL(2.0%）將 100mg DTE溶于5mL0.1mol/L醋酸銨緩沖液中,用1.0 mol/LNaOH 調pH 值至8.9。試驗中,每1.0g牛奶樣品需5mL提取液。需現用現配。

碘乙酰胺溶液40mg/mL(4.0%,w/v）:將200 mg碘乙酰胺溶于5mL0.1mol/L醋酸銨緩沖液中。需現用現配。

C18洗脫液:乙腈∶2%醋酸(20∶80）。

SCX洗脫液:甲醇∶1.0mol/L醋酸銨(15∶85）。

流動相A(0.1%TFA水溶液）:取1mL三氟乙酸,加水至1000mL。

流動相B(0.1%TFA乙腈溶液）:取1mL三氟乙酸,加乙腈至1000mL。

1.5 給藥 以6.6mg頭孢噻呋/kg體重劑量耳根皮下1次給藥。給藥前,每個藥瓶內容物搖晃20～30s,確保混合均勻。

1.6 取樣 乳頭消毒后,擠凈4個乳區,取奶樣50 mL;采樣時間點為 0、6、12 、24、30、36、48、54、60、72、78、84、96、102h 和 108h,共 15 個時間點 。采樣后立即于-20℃保存,直至樣品分析。

1.7 色譜條件 色譜柱:ThermoscientificC18,4.6mm×250mm,5m;檢測波長:266nm;柱溫:30 ℃;進樣體積:40μL。

梯度程序:流動相A(TFA水溶液）為主要成分,流動相B(TFA乙腈溶液）梯度增加。完全梯度洗脫和再平衡的時間為25min,流速為1.0mL/min。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.8 樣品處理 用高效液相色譜法[7]對所取的牛奶樣品進行測定。稱取5±0.05g牛奶樣品于50 mL離心管中,每個樣品中加5mLDTE提取液,充分混合。50C水浴振搖培養15min。于4C下10000r/min離心20min,將上清液轉入另一離心管中,備用。依次用 5mL甲醇、10mL0.1mol/L醋酸銨緩沖溶液預洗C18柱,將上清液轉移至預洗過的C18柱中,并確保溶液慢慢流過C18柱。用5 mL0.1mol/L醋酸銨沖洗兩次,在柱上衍生化以前排干洗滌液。每個C18柱上加5mL碘乙酰胺溶液,使該溶液的過柱時間至少保持30min,保證衍生化反應充分進行。用5mL0.1mol/L醋酸銨緩沖液沖洗兩次,再用5mL2%醋酸溶液沖洗,保持柱子濕潤。再依次用2mL甲醇、2mLC18洗脫液沖洗SCX柱。將C18柱直接放在相應的SCX柱上,用6mLC18洗脫液將C18柱上的衍生化物直接洗脫到SCX柱中。使溶液以適當的速度慢慢通過SCX柱。用1mL甲醇、2mL2%醋酸溶液洗SCX柱,擠干柱子和接口中的溶液。用2.0mL SCX洗脫液洗脫衍生物,收集洗脫液,充分混勻,過0.45μm微孔濾膜,用HPLC進行分析。

2 結果

2.1 標準曲線測定 取 0.02、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0μg/mL6個濃度點進行檢測。其濃度范圍包含了頭孢噻呋在牛奶樣品中的最高殘留限量及實際樣品測定結果。經測定,線性方程為y=0.0729x+0.4511,R2=0.9998。

2.2 實際樣品測定 每天各取6頭牛同一個時間點的牛奶樣品進行測定,每個樣品做平行樣,同時做標準、陰性、陽性對照,并計算其殘留量。共測定九個時間點,測出的最高殘留量為53.6μg/kg,測至72h樣品時,4個奶樣已測不出頭孢噻呋殘留量。為此,其余時間點不再檢測。以采樣時間點為橫坐標,測得的每一時間點殘留量平均值為縱坐標,分別繪制6頭奶牛9個時間點牛奶樣品中頭孢噻呋殘留標志物的消除規律曲線,再繪制出6頭奶牛的平均消除規律曲線。

空白牛奶樣品、實測牛奶樣品與頭孢噻呋殘留標志物的標準溶液色譜圖見圖1A～1C。

6頭奶牛6～72h牛奶樣品中頭孢噻呋殘留標志物殘留量見表2,按時間、殘留量繪制的殘留消除曲線圖見圖2、圖3。

3 討論

圖1 空白牛奶樣品、實測牛奶樣品與頭孢噻呋殘留標志物的標準溶液色譜圖

表2 6～72 h樣品中頭孢噻呋殘留標志物殘留量

對頭孢噻呋在肉牛、奶牛、豬、綿羊等動物體內生物轉化進行的廣泛研究表明,僅有少量頭孢噻呋的β-內酰胺環被破壞,生成極性代謝物,絕大部分頭孢噻呋很快脫去3位硫代基上的呋喃羰基,轉化成去呋喃羰基頭孢噻呋(DFC）,DFC含未受破壞的β-內酰胺環,是頭孢噻呋有抗菌活性的代謝物。DFC在血漿、尿液和組織中極少以游離狀態或原形存在,可通過其3位取代基上的巰基與半胱氨酸、谷胱甘肽形成二硫化合物,還可與血漿蛋白或組織蛋白結合,形成DFC-蛋白復合物[10-12]。歐盟藥物評價中心(EMEA）通過以14C標記頭孢噻呋試驗證明,在牛奶中,頭孢噻呋約有65%以DFC-半胱氨酸二硫化物形式存在,檢測不到原型藥物形式[4]。本試驗檢測牛奶樣品時先將牛奶樣品與二硫赤蘚醇(DTE）溶液共同培養,使頭孢噻呋及DFC有關代謝物從蛋白或含硫化合物中分離,產生DFC。DFC在C18固相萃取柱中與碘乙酰胺反應,生成穩定的DFC乙酰胺衍生物(DCA）,再用強陽離子交換(SCX）柱進行凈化。采用梯度HPLC紫外檢測對DCA衍生物進行分析[7]。保證了試驗結果的科學性和可靠性。

PremSJaglan等曾報道[13]給奶牛肌肉注射頭孢噻呋,每日1次,連用5d,于每一計量后12、24h收集牛奶樣品,直至最后1個劑量后5d。應用Delvotest-P和CharmtestII兩種檢測法對奶樣進行檢測。結果顯示,應用Delvotest-P檢測法未檢到頭孢噻呋殘留;應用CharmtestII方法檢測則可檢測到牛奶樣品中的頭孢噻呋殘留,最后1個劑量后24h,陰性樣品達到90%。但所有陽性奶樣中的頭孢噻呋殘留量均低于當時FDA規定的安全限量。

EMEA也進行了類似的試驗研究[4],給藥時間和采集樣品時間與PremS.Jaglan等人的試驗方案相同。經檢測,第五個劑量后的12h為牛奶中14C-頭孢噻呋殘留最多的時間點,平均殘留量為115 μg/kg,到第24小時和48小時迅速將為60μg/kg和20μg/kg。在另一試驗中,按照相同劑量和用法,給奶牛注射未被14C標記的頭孢噻呋,于最后1個劑量后每隔2h收集奶樣一次,經檢測,第五個劑量后的10h牛奶中頭孢噻呋殘留最多,殘留量為71 μg/kg,到第12h時降為 40μg/kg。

本試驗中,按照頭孢噻呋晶體注射液(牛用）說明書規定,以6.6mg/kg體重劑量耳根皮下1次給藥后,30h～36h奶中的頭孢噻呋殘留標志物濃度達到峰值,最高值為53.6μg/kg;72h時,66.7%奶牛牛乳中已檢測不到頭孢噻呋殘留標志物。本試驗在試驗動物的選擇方面注重了年齡大小和日產奶量的差異性,具有一定的代表性。相同時間點測得各樣品中頭孢噻呋殘留量略有不同,消除速度有快有慢,分析原因可能與奶牛的年齡以及日產奶量等個體差異有關。但總體殘留消除趨勢及殘留量水平與國外其他報道基本相符。包括殘留最高點在內的各時間點殘留量均低于我國農業部2002年第235號公告的規定的100μg/kg。

國內外對于頭孢噻呋在各種動物體內的藥物代謝動力學研究已經證明,頭孢噻呋安全范圍大,體內殘留量低,FDA已確定其無宰前停藥期和牛奶棄奶期。但我國缺乏該藥物在牛奶中殘留消除規律的研究資料,也無有關棄奶期的規定。基于此原因,本試驗進行了頭孢噻呋晶體注射液(牛用）在牛奶中殘留消除規律研究,結果表明,以6.6mg/kg體重劑量耳根皮下1次給藥,各時間點頭孢噻呋殘留標志物濃度均低于最高殘留限量值,且按此劑量對泌乳期奶牛注射頭孢噻呋晶體游離酸后無需棄奶期。

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