脊髓背角PKC在慢性炎性疼痛中的作用及其機(jī)制

索占偉，楊 嫻，曹 靜，劉燕妮，時(shí) 蕾，李 帥，楊鴻斌，胡曉東

(蘭州大學(xué)藥學(xué)院分子藥理研究所，甘肅蘭州 730000)

脊髓背角是痛覺信息傳遞與調(diào)控的第一站。初級傳入纖維通過興奮性谷氨酸能突觸傳遞，將傷害性或非傷害性刺激從外周向中樞輸送。在脊髓背角表達(dá)的3種興奮性谷氨酸能受體中，NMDA受體的功能異常升高，被認(rèn)為在慢性疼痛的形成和維持中發(fā)揮核心作用。而脊髓背角的NMDA受體主要是由2個(gè)功能性NR1亞基和2個(gè)調(diào)節(jié)性NR2A或2個(gè)NR2B亞基組成的四聚體。進(jìn)一步的研究顯示［1］:炎性疼痛能夠特異性提高脊髓背角中“包含NR2B亞基的NMDA受體(簡稱NR2BR)”的突觸表達(dá);當(dāng)特異性阻斷NR2BR后，組織或神經(jīng)損傷誘發(fā)的痛覺超敏和痛覺過敏會被完全取消［2］，提示:NR2BR的突觸表達(dá)亢進(jìn)在慢性疼痛中的作用尤為關(guān)鍵。因此，深入探討NR2BR表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制，對揭示慢性疼痛的中樞發(fā)生機(jī)制和探尋新的藥物鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)具有重要意義。

現(xiàn)已知NMDA受體的突觸表達(dá)受一系列蛋白激酶的調(diào)控。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在突觸傳遞和突觸可塑性過程中發(fā)揮重要作用。資料顯示:活化的PKC可取消Mg2+對NMDA受體的阻斷，增強(qiáng)受體通道的開放［3］;此外，PKC也可通過磷酸化NR1亞基胞質(zhì) C-末端的 S-890、S-896等多個(gè)絲氨酸位點(diǎn)［4－5］，明顯增強(qiáng)NMDA受體的功能。但PKC是否能夠干預(yù)NMDA受體的突觸表達(dá)、并參與慢性疼痛過程，到目前為止尚不清楚。

為探討PKC對NMDA受體突觸功能的調(diào)節(jié)作用及其與炎性疼痛的關(guān)系，本研究利用PKC抑制劑CHE和激動劑PMA，觀察PKC對炎性痛覺超敏的影響，并通過免疫印跡法檢測PKC對脊髓背角NMDA受體亞基突觸表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，探討其參與痛覺調(diào)制的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物昆明種成年小鼠(♂，20～22 g)，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 試劑Chelerythrine(CHE，Sigma);Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA，Sigma);完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA;1 g·L－1Mycobacterium tuberculosis，Sigma);特異性 NR2B、NR2A抗體(Millipore Corporation，Temecula，CA，USA);辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記二抗(Jackson Immuno Research Laboratories，Baltimore，PA，USA);β-actin 抗體、ECL發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天)。

1.3 疼痛模型制備及行為學(xué)測試動物經(jīng)乙醚淺度麻醉后，對照組右后趾皮下注射20 μl生理鹽水，模型組在相應(yīng)部位注射1 g·L－1CFA 20 μl。模型制備前后，采用Up-Down法［6］測定Von Frey纖維誘發(fā)的縮足閾值(PWT)。

1.4 鞘內(nèi)給藥采用微量注射法［7］。動物經(jīng)乙醚淺度麻醉后，用25 μl微量注射器于L5-L6椎間隙經(jīng)皮穿刺，以進(jìn)針產(chǎn)生空洞感和動物甩尾作為針頭進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔的標(biāo)志。進(jìn)針后緩慢注射藥物5 μl，對照組注射同等體積的生理鹽水。

1.5 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離鞘內(nèi)給藥20 min后，經(jīng)苯巴比妥鈉(30 mg·kg－1，ip)麻醉，施行錐形板切開術(shù)，分離L4-L5節(jié)段脊髓，取右側(cè)脊髓段，在4℃細(xì)胞裂解緩沖液中勻漿。勻漿液通過梯度離心，提取富含突觸后密致(PSD)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)［8］。

1.6 免疫印跡用8%SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;經(jīng)5%脫脂奶粉封閉30 min后，以相應(yīng)檢測蛋白的抗體4℃孵育過夜;印跡膜經(jīng)洗滌后，用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，以ECL發(fā)光試劑盒顯像，分子量相同的蛋白應(yīng)用Strip法重顯影;以Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以±s表示;采用Sigma State分析軟件進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，其中行為學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合One-way ANOVA法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 PKC抑制劑CHE對CFA誘發(fā)的痛覺超敏的影響對照組和CFA組右后趾皮下分別注射生理鹽水和CFA，24 h后鞘內(nèi)注射5 μl生理鹽水;CHE組右后趾皮下注射 CFA，24 h后鞘內(nèi)分別給予0.05、0.1、0.2 μg CHE，注射體積均為5 μl。結(jié)果顯示:CFA組動物在注射CFA 24 h后，其縮足閾值明顯低于對照組，提示形成痛覺超敏;與CFA組相比，0.1 μg與0.2 μg CHE 組動物在給藥 10 min 后，縮足閾值開始升高，20 min到達(dá)峰值，且其作用至少持續(xù)30 min，而0.05 μg CHE組縮足閾值在各時(shí)間點(diǎn)均與CFA組無差異，說明CHE可劑量依賴性抑制CFA誘發(fā)的痛覺超敏(Fig 1)。

Fig 1 PKC blocker Chelerythrine reversed the mechanical allodynia induced by CFA( ± s，n=5)

2.2 PKC激動劑PMA對痛覺閾值的影響對照組鞘內(nèi)注射5 μl生理鹽水，試驗(yàn)組分別給予0.01、0.1、1 μg PMA，注射體積均為 5 μl。結(jié)果顯示:與對照組相比，0.01 μg PMA組動物的縮足閾值無明顯改變，而0.1、1 μg PMA給藥組動物縮足閾值明顯下降，并在維持40 min后，逐漸靠近對照組縮足閾值。說明激動PKC可直接誘發(fā)痛覺超敏(Fig 2)。

Fig 2 PKC agonist PMA evoked mechanical allodynia(±s，n=5)

2.3 PKC抑制劑CHE對脊髓背角NMDA受體突觸表達(dá)的影響在行為學(xué)測試后立即分離對照組、CFA組和0.2 μg CHE組動物的脊髓背角，經(jīng)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離得到富含PSD的蛋白樣品，檢測NR2BR和NR2AR的突觸表達(dá)。結(jié)果顯示:與對照組相比，CFA組動物的 NR2BR突觸含量明顯升高，而NR2AR的突觸含量無變化，提示CFA可特異性引發(fā)NR2BR的突觸表達(dá)亢進(jìn);與CFA組相比，CHE組NR2BR突觸含量明顯降低，而NR2AR的突觸含量無明顯改變，提示CHE可特異性逆轉(zhuǎn)CFA引發(fā)的NR2BR突觸表達(dá)亢進(jìn)，從而緩解炎性疼痛(Fig 3)。

Fig 3 PKC blocker Chelerythrine reversed the synaptic expression of NR2B subunit induced by CFA(±s，n=4)

2.4 PKC激動劑PMA對脊髓背角NMDA受體突觸表達(dá)的影響在行為學(xué)測試后，立即分離對照組和1 μg PMA組動物的脊髓背角，檢測NR2BR和NR2AR的突觸表達(dá)。結(jié)果顯示:PMA組動物的NR2BR突觸含量明顯高于對照組，而NR2AR的突觸含量與對照組差異無顯著性。提示PMA可特異性促進(jìn)NR2BR的突觸表達(dá)，從而引發(fā)痛覺超敏(Fig 4)。

3 討論

PKC是體內(nèi)分布廣泛的多功能絲/蘇氨酸激酶，其活化可增強(qiáng)海馬突觸NMDA受體功能和突觸輸送(synaptic trafficking)［9］，但其在炎性疼痛中的作用及其機(jī)制尚不十分清楚。本研究證實(shí)，鞘內(nèi)給予PKC抑制劑CHE可明顯緩解慢性炎性疼痛，同時(shí)明顯逆轉(zhuǎn)CFA引起脊髓背角的NR2BR突觸表達(dá)亢進(jìn)。為進(jìn)一步證實(shí)PKC在痛覺超敏中的作用，本研究設(shè)計(jì)了PKC激動劑PMA對正常小鼠痛覺閾值和NMDA突觸表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射PMA可模擬CFA的效應(yīng)，在誘發(fā)小鼠痛覺超敏的同時(shí)，可選擇性引起突觸NR2BR的表達(dá)亢進(jìn)。由此可見，PKC可通過調(diào)制脊髓背角NR2BR的突觸表達(dá)，在炎性疼痛中發(fā)揮重要作用。

Fig 4 PKC agonist PMA evoked NR2B synaptic accumulation in spinal dorsal horn(±s，n=4)

NMDA受體的兩種NR2亞基在體內(nèi)具有不同的分布特點(diǎn)、發(fā)育規(guī)律以及生理和藥理特性。NR2B亞基是胚胎期主要的NR2受體單元，主要分布于與疼痛傳導(dǎo)密切相關(guān)的前腦和脊髓背角的Ⅰ層和Ⅱ?qū)樱S著發(fā)育大部分逐漸被NR2A亞基所代替。本研究中，皮下注射CFA以及鞘內(nèi)注射PMA均能特異性引起脊髓背角突觸NR2B亞基的表達(dá)升高，但并未影響NR2A亞基的表達(dá)。此結(jié)果與以往的相關(guān)報(bào)道一致［10］，也進(jìn)一步說明了NR2B亞基在炎性疼痛中的主導(dǎo)作用。然而，至目前在NR2B亞基并未發(fā)現(xiàn)直接的絲/蘇氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，推測PKC可能通過其它間接途徑引起NR2B亞基的磷酸化。研究證明，NR2B亞基C末端有Scr家族酪氨酸激酶(SFKs)磷酸化位點(diǎn)NR2B-Y1472，其磷酸化被認(rèn)為是決定NR2B突觸含量的核心因素［11］。而Scr是PKC重要的下游信號分子，因此推測PKC可能通過活化Src，進(jìn)而催化NR2B磷酸化，最終引起突觸表達(dá)的升高［12－13］。另外，PKC 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)涵蓋 PKCα、PKCβ、PKCγ、PKCδ 等多種類型的同工酶，且具有不同功能［14］。本研究所用的 PMA和CHE均屬非特異性PKC調(diào)節(jié)劑，因此，究竟何種特異性同工酶在炎性疼痛中起主導(dǎo)作用，尚需進(jìn)一步研究。

［1］ Yang X，Yang H B，Xie Q J，et al.Peripheral inflammation increased the synaptic expression of NMDA receptors in spinal dorsal horn［J］.Pain，2009，144(1 －2):162 － 9.

［2］ Malmberg A B，Gilbert H，Mccabe R T，et al.Powerful antinociceptive effects of the cone snail venom-derived subtype-selective NMDA receptor antagonists conantokins G and T［J］.Pain，2003，101(1-2):109－16.

［3］ Chen L，Huang L Y.Protein kinase C reduces Mg2+block of NMDA-receptor channels as a mechanism of modulation［J］.Nature，1992，356(6369):521 －3.

［4］ Stephenson F A，Cousins S L，Kenny A V.Assembly and forward trafficking of NMDA receptors［J］.Mol Membr Biol，2008，25(4):311－20.

［5］ 葛志軍，吳偉強(qiáng)，居 剛，等.鞘內(nèi)注射痛穩(wěn)素對甲醛致痛大鼠脊髓PKCα與NMDA受體NR1亞單位磷酸化的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，21(5):693 －4.

［5］ Ge Z J，Wu W Q，Ju G，et al.Ge Modulatory role of intrathecal administration of nocistatin on protein kinase C dependent phosphorylations of the spinal cord PKCα and NMDA receptor subunit NR1 induced by formaldehyde in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，21(5):693 －4.

［6］ Chaplan S R，Bach F W，Pogrel J W，et al.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw［J］.J Neurosci Methods，1994，53(1):55－63.

［7］ Hylden J L，Wilcox G L.Intrathecal morphine in mice:a new technique［J］.Eur J Pharmacol，1980，67(2 －3):313 －6.

［8］ 楊鴻斌，楊 嫻，曹 靜，等.SHP2抑制劑NSC-87877對炎性疼痛的抑制作用及其機(jī)制［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(9):1142－5.

［8］ Yang H B，Yang X，Cao J，et al.Inhibitory effects of SHP2 blocker NSC－87877 on inflammatory pain and its underlying mechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(9):1142 －5.

［9］ Lan J Y，Skeberdis V A，Jover T，et al.Protein kinase C modulates NMDA receptor trafficking and gating［J］.Nat Neurosci，2001，4(4):382－90.

［10］ Chen L，Liu J C，Zhang X N，et al.Down-regulation of NR2B receptors partially contributes to analgesic effects of Gentiopicroside in persistent inflammatory pain［J］.Neuropharmacology，2008，54(8):1175－81.

［11］ Guo W，Wei F，Zou S，et al.Group I metabotropic glutamate receptor NMDA receptor coupling and signaling cascade mediate spinal dorsal horn NMDA receptor 2B tyrosine phosphorylation associated with inflammatory hyperalgesia［J］.J Neurosci，2004，24(41):9161－73.

［12］ Lu W Y，Xiong Z G，Lei S，et al.G-protein-coupled receptors act via protein kinase C and Src to regulate NMDA receptors［J］.Nat Neurosci，1999，2(4):331 －8

［13］ Huang Y，Lu W，Ali D W，et al.CAKbeta/Pyk2 kinase is a signaling link for induction of long-term potentiation in CA1 hippocampus［J］.Neuron，2001，29(2):485 －96.

［14］ Igwe O J.Agents that act by different mechanisms modulate the cativity of protein kinase C βⅡisozyme in the rat spinal cord during peripheral inflammation［J］.Neuroscience，2006，138(1):313－28.