紅車軸草異黃酮抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的研究

陳寒青，孫漢巨，汪錫金，徐學(xué)明，金征宇

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200025;3.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病，其主要病理生化特征為黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性、選擇性變性，導(dǎo)致紋狀體DA含量明顯降低［1］。近年來，越來越多的證據(jù)表明［2－5］:小膠質(zhì)細(xì)胞參與PD的發(fā)病與病情發(fā)展。在受到缺血、損傷或免疫/炎性因素刺激時，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，釋放出一些促炎物質(zhì)，包括促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β和自由基(如NO和氧自由基)，導(dǎo)致神經(jīng)元特別是多巴胺能神經(jīng)元變性、死亡［3，6］。

如何有效地阻止或抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，使神經(jīng)元免于或減少損害，則是目前許多研究者關(guān)注的問題。有研究表明［7］，雌激素可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，且其抑制作用與小膠質(zhì)細(xì)胞上的雌激素受體有關(guān)。但長期服用雌激素會導(dǎo)致激素依賴性疾病，如乳腺癌和前列腺癌，從而限制了雌激素作為PD的藥物在臨床上的應(yīng)用。而植物雌激素——異黃酮具有毒副作用小、使用安全等特點。

目前，關(guān)于植物雌激素異黃酮對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用多局限于對神經(jīng)元本身的作用，如抗凋亡作用［8－9］，而對小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷的影響鮮見報道。

本文通過對從紅車軸草中分離的5種異黃酮(芒柄花素、大豆黃素、毛蕊異黃酮、紅車軸草素、德鳶尾素)對小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷的作用進(jìn)行探討，這不僅有助于闡明PD的發(fā)病機(jī)制，同時也為PD的治療提供新的有價值的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠購于中科院上海實驗動物中心。

1.2 實驗試劑和藥品5種異黃酮(芒柄花素、大豆黃素、毛蕊異黃酮、紅車軸草素、德鳶尾素。本實驗室從紅車軸草中分離得到，經(jīng) UV，MS，NMR鑒定，純度均為95%以上)，化學(xué)結(jié)構(gòu)如Fig 1所示;脂多糖(LPS，Escherichia coli O111:B4，Sigma 公司);［3H］dopamine(DA)(30 Ci/mmol)(Perkin Elmer生命科學(xué)公司，PELS);抗酪氨酸羥化酶抗體(Sigma公司);抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、OX-42單克隆抗體(Chemicon公司);生物素化二抗(抗小鼠)、ABC試劑盒及DAB試劑盒(Vector Laboratories Ins公司);大鼠TNF-α定量免疫測定試劑盒(R＆D公司);NO比色測定試劑盒(Calbiochem公司);細(xì)胞培養(yǎng)用試劑(Invitrogen公司);其余試劑均為Sigma公司產(chǎn)品。

Fig 1 The chemical structure of five isoflavones from Trifolium pratense

1.3 實驗儀器MicroBeta液閃測定儀(PELS公司);IX700倒置顯微鏡(Olympus公司);MultisKan mk3酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermolabsystems公司);AW165-1型CO2培養(yǎng)箱(HAIRIS公司);HNY-100B恒溫?fù)u床(北京瑞爾欣德科技有限公司)。

1.4 異黃酮的前處理先將不同異黃酮以較高濃度(10 mmol·L－1)溶解在二甲亞砜與乙醇混合液(體積比1∶1)中，經(jīng)0.25 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，然后用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成一定濃度待用。

1.5 中腦原代神經(jīng)元 －膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)［10－11］取孕14 d(E14 d)大鼠胚胎，無菌條件下分離中腦腹側(cè)組織(含A8-A10區(qū))，剪碎，胰酶振蕩消化，胎牛血清終止消化，滴管吹打制成細(xì)胞懸液，濾膜過濾，離心，棄上清，加入培養(yǎng)液［MEM+10%FBS(小牛血清)+10%HS(馬血清)+1 g·L－1葡萄糖+2 mmol·L－1L-谷氨酸鹽 +1 mmol·L－1丙酮酸鈉 +100 μmol·L－1非必需氨基酸 +5 ×104U·L－1青霉素+50 mg·L－1鏈霉素］，計數(shù)，依據(jù)不同實驗?zāi)康模謩e以每孔5×105、2.5 ×105、1×105個細(xì)胞數(shù)接種于涂有多聚-D-賴氨酸的24、48、96孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。以上細(xì)胞培養(yǎng)定期換液。

1.6 小膠質(zhì)細(xì)胞純化培養(yǎng)［11］取出生后1 d的乳鼠，無菌條件下取全腦，去腦膜，剪碎，胰酶振蕩消化，胎牛血清終止消化，滴管吹打，濾膜過濾，接種于150 cm2培養(yǎng)瓶(5×107)，14 d后置37℃恒溫?fù)u床，180 r·min－1振搖5 h，收集脫落到上清液中的細(xì)胞，即為小膠質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)免疫組化(OX-42、GFAP)鑒定，純化的小膠質(zhì)細(xì)胞純度在98%以上。

1.7 測定指標(biāo)和方法

1.7.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色(ABC 法)［10－11］培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)3.7%多聚甲醛室溫固定20 min，1%H2O2作用10 min，封閉液(含 1%BSA，0.4%Triton X-100和4%馬血清)作用40 min，加一抗［anti-TH(1∶1 000)、OX-42(1 ∶1 000)］，4℃過夜，加生物素化二抗，37℃孵育1 h，加 AB 混合液，37℃孵育1 h，加底物顯色，終止反應(yīng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并對免疫陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，培養(yǎng)板上每孔隨機(jī)選取10個視野，計數(shù)視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)，每個視野數(shù)兩遍，取平均數(shù)作為該視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)，順序為自上而下，由左至右，不完全位于視野內(nèi)的細(xì)胞不計數(shù)，最后取各視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)的平均值。并表示為對照孔的百分比。

1.7.2 ［3H］DA 攝取力的測定［10－11］培養(yǎng)細(xì)胞用Krebs-Ringer緩沖液(KRB，含 16 mmol·L－1磷酸鈉、119 mmol·L－1氯化鈉、4.7 mmol·L－1氯化鉀、1.8 mmol·L－1氯化鈣、1.2 mmol·L－1硫酸鎂、1.3 mmol·L－1乙二胺四乙酸、5.6 mmol·L－1葡萄糖，pH 7.4)洗 2次，于 37℃ KRB孵育 15 min(含 1 μmol·L－1［3H］DA)，冰 KRB 洗 3 次后，用 1 mol·L－1NaOH溶解細(xì)胞后，用液閃儀測定。對于DA的非特異性攝取，通過加10 μmol·L－1馬吲哚(mazindol)排出。

1.7.3 TNF-α、NO 和超氧自由基的測定 TNF-α測定采用ELISA法，測定波長為450 nm;NO測定依據(jù)Griess反應(yīng)［12］，測定波長為540 nm;超氧自由基測定采用細(xì)胞色素 C還原法［10－11］，測定波長為550 nm。以上測定均參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理每個實驗重復(fù)5次，每次設(shè)3個平行樣品，實驗數(shù)據(jù)均表示為對照組的百分比，以±s形式表示，利用SAS 6.12進(jìn)行單因素的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同異黃酮對中腦混合培養(yǎng)體系DA攝取力的影響如 Fig 2所示，脂多糖(LPS，10 μg·L－1)處理中腦原代混合培養(yǎng)體系，導(dǎo)致培養(yǎng)體系的DA攝取力明顯下降，為對照組的37.2%，但在LPS處理前30 min，加入不同異黃酮(濃度分別為0.25、1.0 和2.5 μmol·L－1，在預(yù)實驗中通過 MTT 檢測觀察到，不同異黃酮在此3濃度下對中腦原代培養(yǎng)體系的細(xì)胞活力無影響)，培養(yǎng)7 d，通過液閃測定法觀測到，不同異黃酮能明顯減輕LPS誘導(dǎo)的DA攝取力的下降，其中以pratensein作用最明顯，其次為 daidzein，以下依次為:calycosin，formononetin，Irilone(Fig 2)，并且異黃酮的作用呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，以2.5 μmol·L－1作用效果最佳。在濃度為 2.5 μmol·L－1時，經(jīng)過 pratensein，daidzein，calycosin，formononetin，irilone預(yù)處理，DA攝取力分別為對照組的80.2%、70.1%、65.7%、60.7% 和 56.1%，并且與LPS處理組比較，差異均有顯著性(P＜0.05)。另外，與vehicle處理的對照組比較，在培養(yǎng)體系中只加入異黃酮，對DA攝取力無影響(P＞0.05)。

Fig 2 Effect of different isoflavones from Trifolium pratense on DA uptake in primary mesencephalic neuron-glia cultures

2.2 不同異黃酮對中腦混合培養(yǎng)體系多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目的影響如Fig 3所示，LPS(10 μg·L－1)處理中腦原代混合培養(yǎng)體系，導(dǎo)致培養(yǎng)體系的DA能神經(jīng)元數(shù)目明顯下降，為對照組的46.7%。但是，在LPS處理前30 min，加入不同異黃酮(濃度均分別為0.25、1.0 和2.5 μmol·L－1)，培養(yǎng)7 d，結(jié)果顯示，上述處理明顯減輕LPS誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元數(shù)目的下降，其作用強(qiáng)弱類似于對DA攝取力的影響，作用強(qiáng)弱依次為 pratensein，daidzein，calycosin，formononetin，irilone(Fig 3)，并且異黃酮的作用呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，以2.5 μmol·L－1作用效果最佳。在濃度為 2.5 μmol·L－1時，經(jīng)過 pratensein，daidzein，calycosin，formononetin，irilone預(yù)處理，DA 能神經(jīng)元數(shù)目分別為對照組的81.1%、71.3%、66.8%、61.8%和57.1%，并且與LPS處理組間差異均有顯著性(P＜0.05)。同樣，與vehicle處理的對照組比較，在培養(yǎng)體系中只加入異黃酮，對DA能神經(jīng)元數(shù)目無明顯影響，與對照組間差異無顯著性(P＞0.05)。

Fig 3 Effect of different isoflavones from Trifolium pratense on the number of DA neurons in primary mesencephalic neuron-glia cultures

2.3 不同異黃酮對中腦混合培養(yǎng)體系中小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎性因子生成的影響如Fig 4A所示，在培養(yǎng)體系中，LPS(10 μg·L－1)明顯誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯增加，而不同異黃酮明顯抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的增加。在濃度為 2.5 μmol·L－1時，經(jīng)過 pratensein，daidzein，calycosin，formononetin，irilone 預(yù)處理，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目分別比LPS處理組降低了51.3%、45.3%、40.5%、36.4%和32.1%，并且與LPS處理組間差異均有顯著性(P＜0.05)。

如 Fig 4B所示，在培養(yǎng)體系中，LPS(10 μg·L－1)明顯誘導(dǎo)TNF-α的生成，而不同異黃酮明顯抑制LPS誘導(dǎo)的該炎性因子的增加，在濃度為2.5 μmol·L－1時，經(jīng)過 pratensein，daidzein，calycosin，formononetin和irilone預(yù)處理，TNF-α的生成量分別比 LPS處理組降低了 37.7%、34.4%、31.3%、28.1%和24.8%，并且與LPS處理組間差異均有顯著性(P＜0.05)。同時，不同異黃酮還明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NO和superoxide的生成量，在濃度為2.5 μmol·L－1時，經(jīng)過 pratensein，daidzein，calycosin，formononetin和 irilone預(yù)處理，NO生成量分別比 LPS處理組降低了 67.3%、62.7%、58.4%、54.3% 和50.6%，superoxide的生成量分別比LPS處理組降低了74.3%、69.7%、65.9%、62.3%和58.7%，并且與LPS處理組間差異均有顯著性(P＜0.05)(Fig 4C，4D)。

Fig 4 Effect of different isoflavones from Trifolium pratense on microglia activation and the production of proinflammatory factors in primary mesencephalic neuron-glia cultures

2.4 不同異黃酮對小膠質(zhì)細(xì)胞純化體系中小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎性因子生成的影響如Fig 5A～C所示，在培養(yǎng)體系中，LPS(10 μg·L－1)明顯誘導(dǎo) TNF-α，NO和superoxide的生成，但是，在LPS處理前30 min，加入不同異黃酮(2.5 μmol·L－1)，培養(yǎng) 7 d，結(jié)果顯示，不同異黃酮明顯抑制LPS誘導(dǎo)的上述炎性因子的生成，經(jīng)過 pratensein，daidzein，calycosin，formononetin和irilone預(yù)處理，TNF-α生成量分別比LPS處理組降低了38.3%、33.5%、29.2%、24.9%和21.1%，NO生成量分別比LPS處理組降低了62.3%、57.1%、52.2%、48.6% 和44.2%，Superoxide的生成量分別比 LPS處理組降低了70.2%、64.9%、60.4%、56.1% 和51.8%，并且與LPS處理組間差異均有顯著性(P＜0.05)。

3 討論

帕金森病是嚴(yán)重危害中老年人生命健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。近年來研究表明［13］，小膠質(zhì)細(xì)胞參與帕金森病的發(fā)病和病情發(fā)展。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫活性細(xì)胞，在腦中黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細(xì)胞密度最高［5］。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是帕金森病腦中重要的病理現(xiàn)象之一，小膠質(zhì)細(xì)胞活化后可通過生成一些促炎因子導(dǎo)致神經(jīng)元變性，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化可達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用［11，14］。如何有效地阻止或抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，使神經(jīng)元免于或減少損害，則是當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)的研究熱點之一。

紅車軸草是一種豆科植物，在我國分布廣泛。紅車軸草中含有豐富的異黃酮，其中雞豆黃素A(biochanin A)、芒柄花素(formononetin)、染料木素(genistein)、大豆黃素(daidzein)、紅車軸草素(pratensein)、毛蕊異黃酮(calycosin)和德鳶尾素(irilone)是紅車軸草中主要的異黃酮。研究表明:染料木素和雞豆黃素A對LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元的損傷具有保護(hù)作用［15－16］。然而，紅車軸草中除了染料木素和雞豆黃素A外，其他5種主要的異黃酮對小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷的影響尚未見報道。

Fig 5 Effect of different isoflavones from Trifolium pratense on the production of proinflammatory factors in primary microglia-enriched cultures

本文研究表明，紅車軸草中這5種異黃酮均能不同程度地抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和促炎因子的生成，減輕多巴胺能神經(jīng)元的損傷，表現(xiàn)為多巴胺攝取力和多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目的增加。在抑制促炎因子生成方面，本實驗觀察了5種異黃酮對TNF-α、NO和超氧自由基的影響。這是因為已有的研究表明［2，17］，在 LPS(10 mg·L－1)處理的中腦原代混合培養(yǎng)體系中，TNF-α、NO和超氧自由基被證明是導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性的主要促炎因素。本實驗結(jié)果表明:來源于紅車軸草的5種異黃酮對超氧自由基的抑制作用似乎較其它兩種因子(TNF-α和NO)的作用強(qiáng)。實際上，前人研究表明，多巴胺能神經(jīng)元由于自身的原因?qū)ρ趸瘧?yīng)激特別敏感，氧自由基被認(rèn)為是導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性的最重要的促炎因子。Liu等［18］研究表明，在LPS處理的中腦原代混合培養(yǎng)體系中，如果一種物質(zhì)能選擇性抑制氧自由基的生成，則它可能是保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免于LPS誘導(dǎo)損傷的有效藥物。

本文還表明，來源于紅車軸草的這5種異黃酮對促炎因子生成和保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用似乎并不表現(xiàn)出完全的一致性。這可能主要是由于以下原因:(1)異黃酮類化合物保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用，不僅與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)，可能還有其它機(jī)制參與。前人［8－9］研究表明，異黃酮類化合物可直接作用于神經(jīng)元，表現(xiàn)出保護(hù)作用。(2)我們觀察到的異黃酮類化合物對促炎因子生成的作用僅限于對某個時間點的觀察。(3)異黃酮類化合物選擇性抑制氧自由基的生成。

本文還發(fā)現(xiàn)，這5種異黃酮對多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用不同，造成這種作用差異的原因可能與它們的雌激素活性有關(guān)。Liu等［19］報道，雌激素通過小膠質(zhì)細(xì)胞中雌激素受體α和β，對活化的小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元的損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。由于異黃酮與雌激素在結(jié)構(gòu)上有類似之處，所以異黃酮可能通過與小膠質(zhì)細(xì)胞上雌激素受體的相互作用，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。而植物雌激素通過與雌激素受體結(jié)合從而顯示雌激素活性。因此，異黃酮與雌激素受體結(jié)合力的大小可以用來評價不同異黃酮雌激素活性的強(qiáng)弱。Kuiper等［20］研究發(fā)現(xiàn)，一些植物雌激素如香豆雌酚(coumestrol)、染料木素、芹菜素(apigenin)、柚皮素(naringenin)、山奈酚(kaempferol)與17β-雌二醇競爭結(jié)合雌激素受體β能力的強(qiáng)弱順序為:genistein=coumestrol＞daidzein＞apigenin=kaempferol=naringenin＞formononetin，這與本文研究結(jié)果異黃酮神經(jīng)保護(hù)作用強(qiáng)弱順序一致。本文研究表明，daidzein的神經(jīng)保護(hù)作用大于formononetin。因此，這5種異黃酮雌激素活性的差異可能導(dǎo)致了其神經(jīng)保護(hù)作用強(qiáng)弱的不同。然而，除了雌激素活性的差異外，并不排除其他的可能性。因此，有必要進(jìn)一步研究闡明這5種異黃酮神經(jīng)保護(hù)作用的差異。

總之，紅車軸草中5種主要的異黃酮對LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元的損傷均具有不同程度的保護(hù)作用，且保護(hù)作用強(qiáng)弱的順序依次為:pratensein＞daidzein＞calycosin＞formononetin＞irilone，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化是其作用機(jī)制之一。

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