纈沙坦改善糖尿病小鼠認知損害及其機制的研究

劉麗萍，唐蘇蘇，王建青，姜荔瑩，張 茜，王肖雲，王 偉，洪 浩

(1.安徽醫科大學第二附屬醫院藥劑科，安徽合肥 230031;2.中國藥科大學藥理學教研室，江蘇南京210009)

糖尿病認知功能損害是臨床上常見的并發癥之一，其發病機制目前尚不清楚。一般認為與腦內蛋白非酶糖基化、腦血管損傷、腦神經遞質改變及神經元凋亡等因素有關［1－2］。近年來研究發現，糖尿病動物腦內β分泌酶活性增高以及血腦屏障β淀粉樣蛋白(β amyloid protein，Aβ)轉運失衡導致腦內Aβ水平異常升高，特別是海馬區Aβ42聚集，海馬區突觸信息傳遞受損，突觸可塑性下降，學習記憶能力減退［3－5］。因此研究糖尿病認知功能障礙的病理生理機制及防治藥物具有重要理論和實際意義。纈沙坦(valsartan)為一臨床上常用的血管緊張素Ⅱ受體1型(即AT1受體)拮抗劑，主要用于治療高血壓。最近不斷研究報道，AT1受體拮抗劑如纈沙坦、替米沙坦等可以明顯改善阿爾采末病(Alzheimer's disease，AD)模型動物認知功能障礙［6－7］。由于糖尿病與AD具有共同的發病機制如胰島素抵抗、晚期糖基化終末產物受體(RAGE)活化及炎癥反應等［9］，因此，AT1受體拮抗劑纈沙坦可能對糖尿病小鼠認知損害具有改善作用。本論文研究采用鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠模型，用Morris水迷宮試驗評價纈沙坦對糖尿病小鼠認知功能的影響，并探究其作用機制，從而為尋找防治糖尿病認知損害的藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物♂ ICR小鼠70只，清潔級，由揚州大學比較醫學中心提供，動物質量合格證號:SCXK(蘇)2007－0001。

1.2 藥物及試劑纈沙坦(海南澳美華制藥有限公司，批號:091001);鏈脲佐菌素(Sigma，批號:100712062);葡萄糖試劑盒及考馬斯亮藍試劑盒購自南京建成生物工程研究所;小鼠Aβ40 ELISA試劑盒、小鼠Aβ42 ELISA試劑盒、小鼠β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(BACE1)ELISA試劑盒及小鼠胰島素ELISA試劑盒均購自R＆D公司。

1.3 儀器Morris水迷宮(上海吉量軟件科技有限公司);16/18型紫外/可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司);酶標儀(Perkin Elmer儀器有限公司);低溫離心機(湖南湘儀實驗室開發有限公司);Sartorius分析天平(北京多利斯天平有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 建立糖尿病小鼠模型及給藥 取♂ ICR小鼠70只，體質量18～22 g，按體重隨機挑選10只為正常對照組;其它60只小鼠在禁食12 h后尾靜脈注射鏈脲佐菌素(150 mg·kg－1)，72 h后眼眶取血，采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖。挑選血糖值≥11.1 mmol·L－1糖尿病小鼠隨機分為3組，即模型組、纈沙坦高劑量組(ValsartanⅠ，40 mg·kg－1·d－1)、纈沙坦低劑量組(ValsartanⅡ，10 mg·kg－1·d－1)，每組12只。正常組和模型組分別給予等體積的溶劑，每天一次，連續4～5周。

1.4.2 Morris水迷宮試驗 為期5天，前4天為定位航行試驗，d 5為空間搜索試驗。水迷宮試驗期間繼續每天灌胃給藥，于給藥30 min后進行試驗。①定位航行試驗:將水迷宮平臺置于第4象限，放入25℃左右水至沒過平臺5 mm。每天從1、2、3、4四個象限(4個入水點)分別將小鼠面向池壁放入水中，使其自由游泳90 s，90 s內小鼠找到平臺并上臺停留10 s后將其從平臺上取下休息，計算機監測并記錄小鼠從入水開始至爬上平臺所需的時間(潛伏期)及穿越平臺的次數等數據。若90 s內動物未找到平臺，則將小鼠引到平臺，并停留30 s，潛伏期記為90 s。②空間搜索試驗:試驗d 5撤除平臺，任選一象限將各組小鼠依次從該象限面向池壁放入水中，使其自由游泳90 s，記錄小鼠在第4象限停留的時間占總時間的百分比(行為學測試過程中應保持光線柔和，房間安靜，各參照物位置不變)。

1.4.3 血糖及胰島素測定 Morris水迷宮試驗結束后小鼠禁食 12 h，眼眶取血，3 000 r·min－1離心15 min分離血清，分別按葡萄糖試劑盒和胰島素ELISA試劑盒說明書規定的方法測定空腹血糖和血清胰島素水平。

1.4.4 小鼠腦組織海馬區和皮層區 Aβ40、Aβ42及BACE1含量測定 將小鼠斷頭取腦，用預冷生理鹽水沖洗表面血液，分離海馬和皮層，分別以重量/體積比1∶5加入4℃生理鹽水，制成約20%的勻漿，3 500 r·min－14℃ 離心 15 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明規定的方法測定Aβ40、Aβ42和BACE1含量，并用考馬斯亮藍定量蛋白。

1.5 統計學處理所有數據均用±s表示。采用SPSS 11.5軟件進行分析，數據比較采用方差分析。

2 結果

2.1 纈沙坦對糖尿病小鼠Morris水迷宮行為學試驗的影響在定位導航試驗中，纈沙坦高劑量和低劑量組小鼠第4天的潛伏期均小于模型組，低劑量組與模型組差異具有統計學意義(P＜0.05)，見Fig 1A;在空間探索試驗中，纈沙坦高劑量和低劑量組小鼠在第4象限停留時間百分率均大于模型組(P＜0.05)，見Fig 1B，C。說明纈沙坦可以改善糖尿病小鼠的學習認知功能障礙。

2.2 纈沙坦對糖尿病小鼠血糖和胰島素水平的影響連續給予糖尿病小鼠纈沙坦40 mg·kg－1·d－1及 10 mg·kg－1·d－1，5 周后小鼠空腹血糖和胰島素水平與模型組相比無差異(P＞0.05)，見Fig 2A，B。

2.3 纈沙坦對糖尿病小鼠腦組織海馬區和皮層區Aβ40和Aβ42含量的影響ELISA分析結果顯示，纈沙坦高劑量和低劑量組小鼠腦組織海馬區Aβ40和Aβ42含量低于模型組(P＜0.05或P＜0.01)，見Fig 3A、4A;并且纈沙坦高劑量和低劑量組小鼠腦組織皮層區Aβ40含量也明顯低于模型組(P＜0.05，見Fig 3B);而皮層區Aβ42的含量未見明顯差異(P＞0.05，見Fig 4B)。說明纈沙坦能降低糖尿病小鼠腦海馬區 Aβ40、Aβ42水平以及皮層區Aβ40水平，而對皮層區Aβ42水平無明顯影響。

2.4 纈沙坦對糖尿病小鼠腦組織海馬區和皮層區BACE1的影響纈沙坦高劑量和低劑量組小鼠腦組織海馬區BACE1的含量低于模型組(P＜0.05或P＜0.01)，見 Fig 5A。而皮層區 BACE1的含量未見改變(P＞0.05)，見Fig 5B。說明纈沙坦降低糖尿病小鼠海馬區Aβ水平與抑制BACE1表達有關。

3 討論

Fig 1 Effects of valsartin on cognitive impairment in diabetic mice induced by streptozocin(±s，n=8～10)

Fig 2 Effects of blood glucose(a)and serum insulin(b)in diabetic mice Values are expressed as the(±s，n=5～10)

Fig 3 Effects of valsartin on Aβ40 content of hippocampus(A)and cortex(B)in streptozocin-induced diabetic mice(±s，n=5～6)

Fig 4 Effects of valsartin on Aβ42 content of the hippocampus(A)and cortex(B)in streptozocin-induced diabetic mice(±s，n=5～6)

Fig 5 Effects of valsartin on BACE1 content of the hippocampus(A)and cortex(B)in streptozocin-induced diabetic mice(±s，n=5～6)

糖尿病腦功能紊亂已在神經化學、電生理、病理及神經行為學等方面得到證實。糖尿病患者在學習、記憶和解決問題的能力、精神運動速度方面有明顯減退［1］。本次水迷宮實驗結果表明，糖尿病小鼠在定位導航試驗中的潛伏期較正常小鼠明顯增加，在空間探索試驗中平臺所在象限停留時間百分率明顯減少，證實了糖尿病小鼠學習記憶功能存在障礙。學習記憶與海馬神經元有密切關系，海馬損傷后會喪失掌握新事物、新技巧的能力。本研究發現糖尿病小鼠海馬內神經元Aβ40和Aβ42含量明顯增加。Aβ42比Aβ40更具纖維原性和毒性，能募集更多的Aβ40和Aβ42，裝配形成以Aβ為主的寡聚體，這種寡聚體的神經毒性進一步增強［9］。

纈沙坦是一種易穿過血腦屏障的AT1受體拮抗劑，能降低AD模型小鼠腦內Aβ水平并且改善其學習認知功能障礙［6］。本研究發現，纈沙坦(10、40 mg·kg－1·d－1)逐漸縮短糖尿病小鼠定位導航試驗尋找平臺的潛伏期，增加糖尿病小鼠空間探索試驗中平臺所在象限停留時間百分率，說明纈沙坦可以改善糖尿病小鼠學習記憶損害。纈沙坦連續給藥5周糖尿病小鼠血糖和血清胰島素水平均未發生明顯的改變，提示纈沙坦改善糖尿病小鼠學習記憶損害與胰島素信號和能量代謝無關。有趣的是纈沙坦能降低糖尿病小鼠海馬區β分泌酶(BACE1)水平，減少Aβ40和Aβ42生成，繼而可以減輕Aβ對海馬區神經元損傷。纈沙坦還能降低糖尿病小鼠腦皮層區Aβ40合成，但對小鼠腦皮層區 Aβ42和BACE1無明顯影響，提示纈沙坦可能具有調節糖尿病血腦屏障上Aβ轉運失衡的功能。

AT1受體是腎素血管緊張素系統(RAS)主要組分，外周組織器官和中樞均有分布。近些年來腦內RAS倍受關注，特別是AT1受體阻斷藥與認知功能關系的研究屢見文獻報道［9］。糖尿病狀態下RAS活性異常升高，AT1受體表達上調，參與糖尿病多種并發癥的發生發展過程［10］。本研究選擇AT1受體拮抗劑纈沙坦兩個劑量即40 mg·kg－1·d－1及10 mg·kg－1·d－1不影響小鼠正常生理狀態如血壓、心功能等［6］，通過抑制糖尿病小鼠海馬區Aβ生成改善學習記憶損害，提示AT1受體上調可能參與糖尿病腦內Aβ過度生成及記憶損害。本論文結果還顯示，纈沙坦低劑量比高劑量更有效，可能是因為低劑量纈沙坦改善認知損害作用選擇性較高，而高劑量產生的藥理作用較廣泛，其它作用干擾了其改善認知損害作用所致。

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