LC2W胞外多糖對大腸桿菌脂多糖誘導RAW264.7細胞因子表達的影響

李瑞君，郭本恒，，吳正鈞，王蔭榆

(1.上海海洋大學食品學院，上海 201300;2.光明乳業股份有限公司技術中心乳業生物技術國家重點實驗室，上海 200436)

乳桿菌對維持腸道內微生態平衡、提高機體抗感染、抗病毒能力，發揮機體局部或全身的防御功能具有重要作用。乳桿菌的生理功能可能與其所分泌的胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)有密切關系［1－2］。藥理研究表明，多糖能激活免疫受體，提高機體免疫功能［3－4］。在用于癌癥輔助治療中，具有毒副作用小、安全性高等優點［5－6］。本實驗通過體外細胞試驗，觀察干酪乳桿菌LC2W胞外多糖(EPS)對小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞活性及分泌細胞因子的影響，為進一步研究LC2W免疫調節作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料干酪乳桿菌LC2W(Lactobacillus casei CGMCC NO.0828)光明乳業技術中心保存。小鼠巨噬細胞系RAW264.7購自中科院上海細胞所。DMEM培養液、0.25%胰酶-EDTA購自美國Gibco公司;TNF-α和IL-10測定試劑盒購自美國R＆D公司。

Tab 1 The expression of TNF-α and IL-10 of RAW264.7 stimulated by EPS(with and without LPS)

1.2 方法

1.2.1 LC2W胞外多糖(EPS)的制備 干酪乳桿菌LC2W于32.5℃發酵26 h。發酵液沸水浴后離心，于上清液中加80%的三氯乙酸至終濃度為4.0%(W:V)，靜置過夜，離心;取上清液超濾(截留分子量10 ku)濃縮;經乙醇沉淀后離心;取上清液去離子水透析(截留分子量12～14 ku)3 d，真空冷凍干燥得多糖EPS。

1.2.2 RAW264.7 細胞培養 RAW264.7 細胞用含 13%胎牛血清的DMEM培養基培養，置37℃，含5%CO295%空氣培養箱中孵育。0.25%胰酶-EDTA消化傳代。取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.3 LC2W胞外多糖(EPS)對RAW264.7細胞釋放細胞因子的影響 不同濃度的 EPS(10、20、40、80 mg·L－1)與生長良好的RAW264.7細胞共孵育24 h后收集上清。設空白對照孔。

1.2.4 LC2W胞外多糖(EPS)對LPS刺激 RAW264.7細胞釋放細胞因子的影響 RAW264.7細胞與不同濃度的EPS(10、20、40、80 mg·L－1)和終濃度為 1 mg·L－1的 LPS 共孵育24 h后收集上清。設空白對照孔。

1.2.5 細胞因子測定(ELISA法)TNF-α和IL-10的測定按試劑盒說明書操作。

1.2.6 LC2W胞外多糖(EPS)對細胞活力影響的測定 采用 MTT 法檢測不同濃度的 EPS(10、20、40、80 mg·L－1)對RAW264.7細胞的毒性作用，490 nm檢測吸光度(A)值。以上實驗每組均設3復孔。所有上清置－80℃保存待測。

1.3 統計學處理實驗結果用SPSS 11.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 LC2W胞外多糖(EPS)對細胞活力的影響為觀察LC2W胞外多糖(以下簡稱EPS)對細胞因子分泌的影響與其細胞毒作用是否有關，檢測其對RAW264.7細胞活力的影響。結果顯示，EPS在10～80 mg·L－1對細胞無明顯損傷作用(P＞0.05)。

2.2 EPS對RAW264.7細胞分泌細胞因子的影響對照組培養上清中TNF-α和IL-10濃度分別為86.37±4.95和75.12 ±4.62 ng·L－1，在加入 EPS后，細胞上清中 TNF-α 濃度與對照組比較雖有一定程度增加，但未見非常明顯差別(P ＜0.01);而40、80 mg·L－1的 EPS刺激IL-10的分泌量有增加(P ＜0.01，Tab 1)。

2.3 EPS對LPS刺激的RAW264.7細胞分泌細胞因子的影響正常細胞上清TNF-α及IL-10含量較低，經LPS刺激后，TNF-α和IL-10含量增加(P＜0.01)，同時加入EPS與細胞共培養后，TNF-α的分泌明顯降低，IL-10的釋放量增加，二者均呈明顯的劑量依賴關系(P＜0.01，Tab 1)。

3 討論

LPS可引起全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syn-drome，SIRS)或急性肺損傷。本實驗表明EPS在體外未顯示明顯細胞毒性，且不同濃度EPS對細胞活力無影響(P＞0.05)，表明其影響細胞因子釋放作用與細胞毒作用無關。EPS可抑制LPS刺激的小鼠RAW264.7細胞釋放炎癥因子TNF-α，并呈一定量效關系。而且還發現EPS能提高小鼠巨噬細胞RAW264.7的細胞因子IL-10的分泌。已有研究證實，IL-10主要生物活性為抑制細胞因子的產生，從而阻止炎癥細胞活化并聚集到炎癥部位［7］。因而推測EPS可以通過調節機體抗炎癥細胞因子的分泌水平發揮免疫抑制作用。

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