銀杏葉提取物EGB761對阿爾茨海默病家兔模型ACAT1和 LCATmRNA表達(dá)的影響*

姜希娟，盧 斌，馬東明，郭茂娟，楊 琳，張瑞峰，王 強(qiáng)，范英昌

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部，天津 300193）

銀杏葉提取物EGB761對阿爾茨海默病家兔模型ACAT1和 LCATmRNA表達(dá)的影響*

姜希娟1，盧 斌2，馬東明2，郭茂娟2，楊 琳2，張瑞峰1，王 強(qiáng)1，范英昌1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部，天津 300193）

[目的]觀察銀杏葉提取物EGB761對阿爾茨海默（AD）病家兔模型膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（ACAT1）和卵磷脂-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（LCAT）mRNA表達(dá)的影響。[方法]以2%高膽固醇飼料喂養(yǎng)雄性新西蘭大白兔，建立AD家兔模型。模型建立后，用50 mg/（kg·d）EGB761灌胃3周作為EGB761組，以5 mg/（kg·d）辛伐他汀作為陽性藥對照組。干預(yù)結(jié)束后,通過實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測海馬卵磷脂-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶mRNA和膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1 mRNA的表達(dá)。[結(jié)果]銀杏葉提取物EGB761可以下調(diào)ACAT1 mRNA的表達(dá)，不影響LCAT mRNA的表達(dá)。[結(jié)論]銀杏葉提取物EGB761可下調(diào)AD家兔模型ACAT1 mRNA表達(dá)，對LCAT mRNA表達(dá)無調(diào)節(jié)作用。

銀杏葉提取物EGB761；阿爾茨海默病；卵磷脂-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶；膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1

近年來，高膽固醇血癥的發(fā)病率呈現(xiàn)不斷上升態(tài)勢，有研究顯示外周膽固醇升高可影響腦膽固醇酯化關(guān)鍵酶卵磷脂-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（LCAT）和膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（ACAT1）的表達(dá)，進(jìn)而影響游離膽固醇和膽固醇酯的平衡。細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯，而非細(xì)胞總膽固醇水平可能是影響β-淀粉樣蛋白過度合成的因素。β-淀粉樣蛋白沉積是阿爾茨海默病（AD）的特征性改變，以海馬部位最為明顯。因此，探尋調(diào)節(jié)膽固醇酯化關(guān)鍵酶的藥物可能是防治AD的可行思路。

銀杏葉提取物EGB761在臨床上被廣泛應(yīng)用于預(yù)防AD，然而其具體作用機(jī)制尚未闡明[1]。筆者假定EGB761通過調(diào)節(jié)膽固醇酯化關(guān)鍵酶的表達(dá)，從而影響β-淀粉樣蛋白合成，是其防治AD的機(jī)制之一，并參照Sparks等[2]方法復(fù)制AD家兔模型，觀察EGB761，對ACAT1和LCAT表達(dá)的影響，為EGB761的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑 銀杏葉提取物EGB761（商品名：金納多），德國威瑪舒培博士藥廠，批號:9840808。辛伐他汀（商品名：賽夫丁），南通華山藥業(yè)有限公司，批號：081202。其余試劑均為市售分析純。

1.2 動物模型的建立 39只健康成年雄性新西蘭大白兔（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心），體質(zhì)量為（2 356±212）g，先給予普通飼料和自來水適應(yīng)喂養(yǎng)2周，溫度（28±2）℃，濕度為 37%～48%。2周后，隨機(jī)取出9只作為對照組，飼以普通飼料，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共9周。其余30只家兔參照D.Larry Sparks等[2]方法，采用2%高膽固醇飼料喂養(yǎng)6周，以復(fù)制高膽固醇血癥家兔的造模[1]。此時對照組血清總膽固醇一般低于60 g/L，其他各組血清總膽固醇若高于1 400 g/L，提示高膽固醇血癥模型復(fù)制成功，未達(dá)到1 400 g/L者則要淘汰出實(shí)驗(yàn)。結(jié)果30只家兔造模成功28只，淘汰2只，另因高膽固醇血癥導(dǎo)致腦部疾患死亡2只。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法 將26只造模成功的家兔隨機(jī)分為模型組（n＝8），繼續(xù)給予高膽固醇飼養(yǎng)3周；陽性藥辛伐他汀組（n=8），辛伐他汀5 mg/（kg·d）灌胃3周，其余處理同模型組；EGB761組（n＝10），EGB761 50 mg/（kg·d）灌胃3周，其余處理同模型組。藥物干預(yù)結(jié)束后，斷頭取海馬，冷凍待測。

1.4 ACAT和LCATmRNA的表達(dá) 采用Trizol試劑盒提取血管總RNA。依試劑盒說明書,采用Taq－Man Reverse Transcrip tion Reagents試劑盒和PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用SYBR Green PCR MasterMix reagent kits試劑盒和特異性引物（見表1）數(shù)據(jù)采用2-△△CT相對定量法[1]分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS16.0 軟件包進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 引物種類和引物序列Tab.1 Primer type and primer sequences

2 結(jié)果

外周膽固醇升高可以上調(diào)海馬ACAT1 mRNA的表達(dá)，與對照組相比差異有顯著性（P<0.05）。陽性對照藥辛伐他汀和EGB761均可下調(diào)ACAT1 mRNA的表達(dá)，與模型組相比差異有顯著性（分別為P<0.05和P<0.01）；EGB761效果優(yōu)于辛伐他汀（P<0.05）。外周膽固醇有上調(diào)海馬LCAT mRNA的趨勢，但與對照組相比差異無顯著性（P>0.05）。陽性對照藥辛伐他汀可進(jìn)一步上調(diào)LCAT mRNA的表達(dá)，與模型組相比差異有顯著性（分別為P<0.05）；EGB761與模型組相比差異無顯著性（P>0.05）。辛伐他汀效果優(yōu)于EGB761（P<0.05）。（見表2）。

3 討論

膽固醇酯化家族主要包括ACAT1，ACAT2和LCAT。其中ACAT1是細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯化的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和酯化膽固醇的平衡。ACAT1可促進(jìn)24s-羥膽固醇形成，過多的24s-羥膽固醇激活γ分泌酶促進(jìn)β-淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）轉(zhuǎn)化為β-淀粉樣蛋白。因此，抑制ACAT1表達(dá)可以間接抑制β-淀粉樣蛋白產(chǎn)生，從而起到治療AD的效果。與ACAT1作用的靶點(diǎn)不同，LCAT可將細(xì)胞外HDL的游離膽固醇酯化，研究發(fā)現(xiàn)外周膽固醇升高對LCAT無顯著影響。

表2 銀杏葉提取物EGB761對AD家兔模型海馬ACAT1和LCAT mRNA表達(dá)的影響(±s)Tab.2 Effect of Ginkgo biloba extract in EGB761 on the mRNA expression of ACAT1 and LCAT in hippocampus tissue in rabbit with Alzheimer disease(±s)

表2 銀杏葉提取物EGB761對AD家兔模型海馬ACAT1和LCAT mRNA表達(dá)的影響(±s)Tab.2 Effect of Ginkgo biloba extract in EGB761 on the mRNA expression of ACAT1 and LCAT in hippocampus tissue in rabbit with Alzheimer disease(±s)

注:與模型組比較，※P<0.05，※※P<0.01；與辛伐他汀組比較，▼P<0.05。

組別對照組模型組辛伐他汀組EGB761組ACAT1 mRNA 1.13±0.18※2.61±0.67 1.97±0.41※1.07±0.26※※▼LCAT mRNA 0.99±0.25 1.47±0.11 2.42±1.17※1.53±0.59▼n 9 8 8 1 0

本研究首次發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物EGB761對于細(xì)胞外膽固醇酯化關(guān)鍵酶LCAT無調(diào)節(jié)作用。同時本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物EGB761可以有效下調(diào)海馬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯化關(guān)鍵酶ACAT1 mRNA的表達(dá)，這可能是EGB761抑制β-淀粉樣蛋白產(chǎn)生的機(jī)制之一，然而，其調(diào)節(jié)效果差于辛伐他汀。EGB761對細(xì)胞外膽固醇酯化關(guān)鍵酶LCAT無調(diào)節(jié)作用。

[1] Le Bars PL,Katz MM,Berman N,et al.A placebo-controlled,double-blind,randomized trial of an extract of Ginkgo biloba for dementis[J].JAMA,1997,278:1327-1330.

[2] D.Larry Sparks.Coronary Artery Disease,Hypertension,ApoE,and Cholesterol:A Link to Alzheimer’s Disease[J].Ann NY Acad Sci,1997,826(13):128-146.

Effect of ginkgo biloba extract EGB761 on the mRNA expression of ACAT1 and LCAT in rabbit with Alzheimer‘s disease

JIANG Xi-juan,LU Bin,MA Dong-ming,et al
（Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China）

[Objective]To observe whether Ginkgo biloba extract EGB761 can influence the expression of ACAT1 and LCAT mRNA in rabbit with Alzheimer’s disease.[Methods]The male adult New Zealand rabbits were fed by 2%high cholesterol feed in order to establish the model of Alzheimer’s disease.EGB761 was used to treat the rabbits at a dose of 50 mg/（kg·d） for 3 weeks as EGB761 group.Simvastatin was fed at a dose of 5 mg/（kg·d） as a positive control drug.After intervention,the content of lecithin-cholesterol acyl transferase mRNA and cholesterol acyltransferase mRNA in hippocampus was tested by means of real-time quantitative RT-PCR.[Results]The content of ACAT1 mRNA in hippocampus was reduced by Ginkgo biloba extract EGB761,P<0.01 compared with model group.But the content of ACAT1 mRNA was not significant different compared with model group(P>0.05).[Conclusion]Ginkgo biloba extract EGB761 can down-regulate the expression of ACAT1 mRNA in rabbit with Alzheimer’s disease,however,it has no effect on the expression of LCAT mRNA.

ginkgo biloba extract EGB76；Alzheimer’s disease;Lecithin-cholesterol acyl transferase;cholesterol acyltransferase 1

R285.5

A

1672-1519(2011)01-0059-02

天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（08JCYBJC10800），高校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（20101210120008）。

姜希娟(1972-)，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治心腦血管疾病的研究。

范英昌。

2010-12-20）