利用Cre/loxP系統構建無標記的htrA基因缺失的變鏈菌突變株

張文娟 于丹妮 韓育植 任志明

齲病是影響人類健康的三大疾病之一，其主要致病菌是變異鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mu?tans,以下簡稱變鏈菌)。變鏈菌是牙菌斑生物膜的重要組成成分，在人類口腔中占有重要的生態地位。對變鏈菌致齲機制尤其是對其致病因子的研究一直是口腔醫學領域的熱點。HtrA（high tempera?ture requirement A）蛋白是一種熱休克誘導的絲氨酸蛋白酶，它具有分子伴侶和蛋白酶的雙重功能，其主要的作用是幫助細菌在高溫、低pH值和氧化應激等不良環境下生長。在革蘭陽性菌中，HtrA蛋白參與了許多具有致病性的表面蛋白的合成[1-2]，而且HtrA蛋白已被證明是肺炎鏈球菌的毒力因子[3]。因此，HtrA蛋白可能在變鏈菌的致齲過程中發揮著重要的作用。本研究擬構建HtrA蛋白編碼基因htrA缺失的變鏈菌突變株，為進一步明確HtrA蛋白在變鏈菌致齲過程中的作用機制提供實驗菌株。

1 材料與方法

1.1 材料 變鏈菌國際標準株UA159（Ingbritt，血清C型），購自四川大學華西口腔醫學中心；含卡那霉素（Km）抗性基因的質粒pUC4ΩKm2由美國馬里蘭大學Kevin McIver教授惠贈；質粒pCrePA由美國堪薩斯大學Indranil Biswas教授惠贈；pGEM-T-Easy TA載體和T4 DNA連接酶（Promega北京）；大腸桿菌DH5α由本實驗室保存；氨芐青霉素、卡那霉素、紅霉素粉劑（中國藥品生物制品檢定所標準產品）；T4 DNA聚合酶、限制性內切酶BaeⅠ和PflMⅠ（NEB公司）；細菌基因組提取試劑盒、質粒小提試劑盒、小量膠回收試劑盒（Biomiga）；Taq PCR Master Mix試劑盒、pfu PCR Master Mix試劑盒、DNA分子質量MarkerⅢ、Marker DL15000、MarkerⅦ（天根，北京）；TSA瓊脂平板、TPY液體培養基、LB培養基由本實驗室配制。所有引物均由上海生工生物公司合成；DNA測序由華大基因（北京）公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養 -20℃保存的變鏈菌國際標準株于常溫下復蘇，接種于胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）固體平板，于37℃厭氧條件下（85%N2、10%H2、5%CO2）培養24 h，形態學和生化鑒定后挑取單個菌落接種于10 mL TPY液體培養基中靜置培養24 h增菌。含質粒的大腸桿菌接種于LB平板或液體培養基中于37℃恒溫搖床中孵育。

1.2.2 PCR擴增目的基因 （1）采用細菌基因組提取試劑盒，按試劑盒說明提取變鏈菌標準株基因組DNA。使用紫外分光光度計測定所提變鏈菌基因組DNA的濃度和純度，純度用比值A260/A280表示（A為吸光度），1%瓊脂糖凝膠電泳80 V，40 min檢測其分子質量大小，置-20℃保存備用。（2）以變鏈菌基因組DNA為模板，與引物P1（5-gactagcattatttggaattttctcatc?gg-3）和P2（5-gaggtgagatatgaagacaacttcgttgac-3），進行PCR擴增包含整個htrA基因在內的1.9 kb的DNA片段。PCR反應條件為94℃5 min，94℃1 min，53℃1 min，72℃1 min，72℃15 min，共30個循環。以質粒pUC4ΩKm2為模板，PCR擴增Km抗性基因，引物為loxP-Km-F(5-cgATAACTTCGTATA?ATGTATGCTATACGAAGTTATgaggatgaagaggatgaggaggcag-3，大寫字母為loxP位點）和loxP-Km-R（5-cgATAACTTCG?TATAGCATACATTATACGAAGTTATgctttttagacatctaaatctagg-3），PCR反應條件為94℃5 min，94℃30 s，52℃30 s，72℃1 min，72℃10 min，共30個循環。擴增產物分別用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用小量膠回收試劑盒純化回收。

1.2.3 htrA基因片段克隆到pGEM-T-Easy TA載體 將擴增的htrA基因片段連接入pGEM-T-Easy TA克隆載體內，采用T4 DNA連接酶于4℃過夜，電轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將菌液涂布于氨芐青霉素（100 mg/L)抗性的LB平板上，37℃培養，過夜，挑取陽性克隆增菌后提取質粒，得到重組質粒pGEM-T-htrA，NotⅠ酶切鑒定。

1.2.4 Km抗性基因盒（loxP-Km-loxP）替換htrA基因的部分序列 采用限制性內切酶BaeⅠ、PflMⅠ雙酶切重組質粒pGEM-T-htrA（該酶切位點均在htrA基因內），并采用T4 DNA聚合酶使末端平齊化，1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠，純化回收分子質量較大的片段。采用T4 DNA連接酶于4℃過夜，將大片段與loxP-Km-loxP連接，連接產物電轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞，將菌液涂布于氨芐青霉素和Km(50 mg/L)抗性的LB平板上，37℃過夜培養，挑取陽性菌株增菌后提取質粒，得到htrA基因缺失的同源重組載體pIB△htrA-Km，NotⅠ酶切及DNA測序鑒定。

1.2.5 帶Km抗性的htrA基因缺陷株的構建 采用限制性內切酶NotⅠ酶切質粒pIB△htrA-Km，1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化回收小片段，并將該小片段電擊轉化感受態變鏈菌標準株，將菌液涂布于Km（300 mg/L）抗性的TSA平板上37℃厭氧培養48 h，挑取陽性菌株于TPY培養液中增菌后提取基因組DNA,利用引物對P3（5-aataacgaaggtcaaatcagaa-3）和P4（5-atatctttagtattaagatatt-3）進行PCR鑒定，并以標準株為對照。

1.2.6 Cre重組酶介導的Km抗性基因的刪除 將Cre重組酶表達質粒pCrePA電轉化感受態的帶Km抗性的htrA基因缺陷株，將菌液涂布于含紅霉素（Em，10 mg/L）的TSA平板上，30℃過夜培養，篩選得到陽性轉化株。再將陽性轉化株平行接種于含Em、Km的TSA平板和只含Em的TSA平板，30℃培養48 h，篩選出Em抗性、Km敏感的菌株。將該菌株平行接種于含Em的TSA平板和不含抗生素的TSA平板，37℃過夜培養，篩選得到Em敏感的菌株。選擇10個菌株，利用引物對P3/P4進行PCR分析及DNA測序鑒定，鑒定出的突變株即為無標記的htrA基因缺陷株。

2 結果

2.1 PCR產物的分子質量鑒定 本研究以變鏈菌國際標準株全基因組DNA為模板擴增出的包含基因htrA的DNA片段大小約為1.9 kb，Km抗性片段大小約為1.5 kb，見圖1。未見非特異性擴增及拖尾現象，分子質量大小與預計大小相同。

圖1 PCR擴增片段瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 重組質粒pGEM-T-htrA的酶切鑒定 采用限制性內切酶NotⅠ酶切重組質粒pGEM-T-htrA后（htrA基因克隆位點兩側均有NotⅠ酶切位點），1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果可見2條各為3.0 kb和1.9 kb的條帶，分別與空載體和擴增片段的預期大小一致，見圖2。

圖2 pGEM-T-htrA NotⅠ酶切瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 htrA基因缺失的同源重組載體pIB△htrA-Km的鑒定 限制性內切酶BaeⅠ和PflMⅠ雙酶切pGEM-T-htrA（BaeⅠ和PflMⅠ酶切位點都位于htrA基因內），得到大片段4 108 bp和小片段818 bp，見圖3，大片段與loxP-Km-loxP連接轉化后，含目的質粒的大腸桿菌可在含有Km的LB培養基內生長良好，證明Km基因正確表達，大片段與loxP-Km-loxP正確連接。NotⅠ酶切載體pIB△htrA-Km后，1%瓊脂糖凝膠電泳可見2條帶分別為2 981 bp和2 627 bp，與預期大小一致，見圖4。DNA測序結果與已獲得的預期序列比較，未見堿基突變的發生，說明同源重組載體構建成功。

圖3 pGEM-T-htrA雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 帶Km抗性的htrA基因缺陷株的鑒定 質粒pIB△htrA-Km的小片段電轉化變鏈菌標準株后，篩選出的菌株可在含Km的TSA及TPY培養基中生長較好，說明Km抗性基因正確重組到變鏈菌標準株的基因組中，并正確表達。PCR鑒定結果，見圖5，標準株擴增片段為2 250 bp，帶Km抗性的htrA基因缺陷株擴增片段為2 932 bp，條帶單一清楚，分子質量大小與預期大小相符。

圖4 pIB△htrA-Km NotⅠ酶切瓊脂糖凝膠電泳圖

圖5 標準株與突變株PCR擴增片段瓊脂糖凝膠電泳圖

2.5 無標記的htrA基因缺陷株的鑒定 與變鏈菌標準株和帶Km抗性的htrA基因缺陷株相比，選擇的10個菌株中有2個菌株PCR擴增的條帶大小為1 500 bp,與預期大小一致，見圖6。DNA測序顯示htrA基因部分序列已被刪除，并無Km抗性基因，該位點只留有一個loxP位點。

圖6 無標記突變株PCR擴增片段瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

變鏈菌要在口腔環境中生存定植，必須適應復雜多變的口腔環境。這需要多種蛋白酶的參與，其中重要的一種是HtrA蛋白。HtrA蛋白是絲氨酸蛋白酶家族成員，在細菌的耐熱特性中發揮著重要的作用，當環境溫度升高時，它可參與細胞質內異常蛋白的降解[1-2]。在革蘭陽性菌中，HtrA蛋白在細菌的致病過程中發揮了重要作用。對肺炎鏈球菌的研究表明，HtrA蛋白的編碼基因htrA缺失時，3種重要的毒力因子PspA、NanA和LytA的表達均顯著下降[4]。在金黃色葡萄球菌中，htrA基因缺失后可影響較多致病因子的分泌和表達[5]。

在變鏈菌中，有7種不同的細胞外或細胞壁相關蛋白的表達皆受htrA基因的調控[6]。Biswas等[7]認為，HtrA蛋白可影響變鏈菌糖酵解有關的細胞外酶，從而進一步影響變鏈菌生物膜的形成能力，最終影響變鏈菌的致齲能力。為了更好地研究變鏈菌中HtrA蛋白的生物學功能及其致齲機制，本研究利用雙交換同源重組原理，使loxP-Km-loxP替換htrA基因內的部分序列，成功構建出htrA基因缺陷株。在這種框內缺失突變株的構建中，抗性基因盒的存在可因抗性的獲得而易于選擇。但是，這些基因盒帶有異源基因（抗性標記），如果這些標記被廣泛應用于選擇轉化子，它們可能會產生無法預知的有害影響[8]。因此，本研究利用Cre/loxP位點特異性重組系統刪除Km抗性標記。

Cre/loxP重組系統是一種有力的DNA重組工具。它來源于噬菌體P1，由Cre重組酶和loxP位點2部分組成。Cre重組酶屬于位點專一性重組酶的整合酶家族。loxP位點是一種典型的回文序列結構，長34 bp，包括兩側的2個13 bp的反向重復序列和中間的8 bp的非對稱間隔序列。Cre重組酶識別并結合兩側的13 bp反向重復序列并介導中間的8 bp間隔區發生重組，它不需要任何宿主輔助因子和輔助蛋白[9]。在Cre酶的介導下，當2個loxP位點位于同一個分子上且方向相同時，loxP位點之間的DNA片段可被刪除，只留下一個loxP位點[10]。

本研究利用Cre/loxP系統的刪除基因的原理，通過設計引物PCR擴增將2個同向的loxP位點錨定在Km抗性基因的兩端，構建出Km抗性基因盒loxP-Km-loxP，為Km抗性基因的刪除做好準備。另外，cre基因的表達質粒需具有2個重要的特點：（1）含有一個抗性基因作為篩選標記。（2）含有一個熱敏復制子，以利于消除cre表達質粒。本研究使用質粒pCrePA，它含有Em抗性基因和熱敏復制子pWV01[11]，其允許、限制溫度分別是30℃和37℃。pCrePA電轉化變鏈菌后，30℃培養，Em抗性篩選出轉化株，Cre重組酶表達并刪除Km抗性基因；37℃培養，pCrePA不能復制，因而被消除。

最后DNA測序證明本研究成功構建出無標記的htrA基因缺失的變鏈菌突變株，為進一步研究htrA基因的功能，明確HtrA蛋白在變鏈菌致齲中的調控作用及分子機制奠定了實驗基礎。目前關于變鏈菌標準株和突變株的相關功能差異研究正在進行中。

[1]Faccio L,Fusco C,Chen A,et al.Characterization of a novel human serine protease that has extensive homology to bacterial heat shock endoprotease HtrA and is regulated by kidney ischemia[J].J Biol Chem,2000,275(4):2581-2588.

[2]Vaux DL,Silke J.Mammalian mitochondrial IAP binding proteins [J].Biochem Biophys Res Commun,2003,304(3):499-504.

[3]Hava DL,Camilli A.Large-scale identification of serotype 4 Strep?tococcus pneumoniae virulence factors[J].Mol Microbiol,2002,45 (5):1389-1406.

[4]黃遠帥，許頌霄，朱旦，等.HtrA基因缺陷對肺炎鏈球菌毒力影響的研究[J].第四軍醫大學學報，2006，27（17）：1542-1546.

[5]Rigoulay C,Entenza JM,Halpern D,et al.Comparative analysis of the roles of HtrA-like surface proteases in two virulentStaphylococ?cus aureusstrains[J].Infect Immun,2005，73(1):563-572.

[6]Diaz-Torres ML,Russell RR.HtrA protease and processing of extra?cellular proteins of Streptococcus mutans[J].FEMS Microbiol Lett, 2001,204(1):23-28.

[7]Biswas S,Biswas I.Role of HtrA in surface protein expression and biofilm formation by Streptococcus mutans[J].Infect Immun,2005, 73(10):6923-6934.

[8]Raynal A,Karray F,Tuphile K,et al.Excisable cassettes:new tools for functional analysis of Streptomyces genomes[J].Appl Environ Microbiol,2006,72(7):4839-4844.

[9]Hoess RH,Ziese M,Sternberg N.P1 site-specific recombination: nucleotide sequence of the recombining sites[J].Proc Natl Acad Sci USA,1982,79(11):3398-3402.

[10]Shimshek DR,Kim J,Hübner MR,et al.Codon-improved Cre re?combinase(iCre)expression in the mouse[J].Genesis,2002,32(1): 19-26.

[11]Pritzlaff CA,Chang JC,Kuo SP,et al.Genetic basis for the be?ta-haemolytic/cytolytic activity of group BStreptococcus[J].Mol Microbiol,2001,39(2):236-247.