止凝血研究在膿毒癥中的進展

任 靜 門劍龍

在膿毒癥所致的多器官功能障礙的病理發展過程中，外周微循環的干擾，白細胞和活化補體對組織和細胞的損害，使患者內皮細胞、血小板和凝血系統功能紊亂，從而導致彌漫性血管內凝血（DIC）的發生。研究表明，止凝血系統的功能紊亂與患者預后密切相關，盡管有關膿毒癥的相關抗凝血治療研究獲得進展，但除了活化蛋白C替代療法外，近期幾乎所有的關于膿毒癥抗凝、抗炎的臨床試驗均未成功[1]。膿毒癥仍伴隨很高的病死率。對于膿毒癥的研究目前已經逐步拓展到對于DIC的早期診斷、預后評估以及血管內皮損傷等領域，現就相關膿毒癥止凝血研究現狀綜述如下。

1 膿毒癥DIC與創傷DIC

目前，國際上許多機構，包括日本厚生勞動省、國際血栓與止血協會（ISTH）和日本急診醫學協會（JAAM）都提出了關于DIC的診斷標準。這些標準中均采用凝血酶原時間、血小板計數、纖維蛋白原、纖維蛋白（原）降解產物或D-二聚體等指標用于止血異常監測。其中JAAM的DIC診斷標準的敏感性在幾套標準中是最高的，但特異性尚不清楚[1]。嚴重膿毒癥的病死率約為35%～45%，其中合并DIC的患者的病死率高于未合并DIC的患者，表明膿毒癥患者的DIC發生頻率很高且預后不良[2]。所以早期診斷和治療DIC，對最終預防膿毒癥DIC所致死亡是必要的。創傷患者（特別是頭部外傷）存在凝血紊亂，可導致DIC的頻繁發生，其程度與膿毒癥類似，但膿毒癥患者的28 d病死率顯著高于創傷患者[3]。另一項關于頭部外傷患者的前瞻性研究顯示，合并DIC患者比未合并DIC患者的預后更差，與創傷患者比較，膿毒癥患者表現為血小板更低，凝血酶原時間比率更高，以及更高的組織衰竭積分，而第3天創傷患者的DIC緩解的比例顯著高于膿毒癥患者[3]。超過50%的根據JAAM標準診斷的膿毒癥合并DIC患者在28 d內死亡，而這些患者在最初的3 d是無法利用ISTH的DIC標準進行鑒別的。提示ISTH關于DIC的診斷標準對診斷膿毒癥患者早期DIC敏感性不足[1]。

有研究者認為合并DIC的創傷與合并DIC的膿毒癥具有相同的病理生理過程，但創傷的DIC發生機制可能不同于膿毒癥的DIC[4]。ISTH下屬的科學標準委員會的DIC分會對膿毒癥并發DIC進行定義時，強調血管內皮細胞損傷和炎癥反應[5]。而創傷后的DIC，則是腦組織、脂肪、羊水或其他強促凝物質進入血液循環，造成DIC急性發作；當血管內皮細胞進一步炎癥損傷或功能障礙，清除活化凝血因子的能力減弱，使微血栓形成并造成二次損傷和DIC加重，從而引發了亞急性DIC[6]。兩者機制上的差異是明顯的。Kushimoto等[3]研究認為，在創傷患者和膿毒癥患者間，凝血功能異常、器官功能紊亂和DIC預后存在顯著的差異。

2 血小板在膿毒癥所致的內皮細胞損傷過程中的作用

血小板除具有止血功能外，還是病原微生物侵入時調節免疫反應的重要介質。膿毒癥時循環中的血小板能夠與脂多糖結合，經由Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）介導，結合中性粒細胞，并誘導白細胞外殺菌途徑（neutrophil extracellular traps，NETs）的形成。TLRs主要參與機體感染防御，但在全身感染時也參與損傷性的微血管功能紊亂和器官衰竭。隨后產生腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）的合成，最終導致內皮細胞損傷和血管炎[7]。在膿毒癥時，細菌性產物可顯著改變血小板在網狀內皮系統噬菌過程中的作用，并且還影響血小板的快速清除和早期的炎癥過程[8]，但直至目前為止，尚沒有足夠的研究證明，細菌性產物可以引起血小板自身對血管內皮細胞的直接影響。

Kuckleburg等[9]通過觀察負載細菌的血小板與內皮細胞間的相互作用發現通過生成ROS可激活半胱天冬酶（Cas?pase）8和Caspase9以誘導凋亡，而FasL/Fas間的交互作用似乎是獨立的，研究認為抑制血小板與內皮細胞相互間的作用可減輕內皮細胞的損傷并改善膿毒癥患者的病情。這種關于血小板經由ROS生成誘導凋亡的新機制同樣不能體現出與TNF-α之間的關聯。Semple等[10]認為血小板CD40L-內皮細胞CD40間的交互作用對介導內皮細胞死亡可能是重要的（可能是通過FasL/Fas旁路的交互作用實現的）。正常情況下，CD40-CD40L在內皮細胞、T細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞上表達，由于血小板-內皮細胞黏附過程是通過CD40-CD40L誘導促炎性介質和組織因子的釋放以及黏附因子表達實現的，因此CD40-CD40L在血管損傷時大量表達于內皮細胞[11]。越來越多的證據支持膿毒癥時血小板在細菌介導的炎癥反應中產生關鍵作用，且血小板自身能夠直接誘導內皮細胞死亡[12]。這種新的血小板依賴機制顯示，血小板通過誘導內皮細胞的凋亡和暴露內皮下細胞外基質，直接導致了血管炎癥和血栓形成。關于膿毒癥時血小板-細菌-內皮細胞之間相互作用的研究可提高對血小板如何介導血管并發癥的認識。

3 雙相（BPW）活化部分凝血活酶時間（APTT）測定對膿毒癥的診斷

Downey等[13]于1997年在對DIC患者進行APTT檢測時，發現在血漿凝固過程中存在異常的透射波形，在血漿凝固前先出現假性凝固曲線，即BPW，該試驗稱為“雙相APTT”。隨后的研究證明BPW與血管內凝血無關，其發生原因是鈣離子依賴的C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）和極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，vLDL）復合物形成所致的透光度改變[14]。CRP可能以某種方式參與脂蛋白代謝，而感染時產生某些因素（如內毒素）可誘導肝臟vLDL分泌增加，內毒素對vLDL的結構有直接的影響，可改善心臟的能量利用。目前，已有大量研究表明，BPW可作為一種全身炎癥反應綜合征的指示性指標，可用于膿毒癥和早期DIC的診斷。Cho?pin等[15]研究顯示，BPW診斷嚴重膿毒癥的敏感性為90%，對膿毒性休克的陰性預期值為92%，其鑒別上述2種疾病的準確性優于CRP和降鈣素原（procalcitonin，PCT）；與死于其他疾病的患者相比，BPW在最初1～3 d中更多地出現于死于膿毒癥的患者，BPW在對與膿毒癥相關的3 d病死率的預后評價中表現出極佳的特異性（91%）和陰性預期值（98%）。近期的一項研究顯示，雙相APTT對重癥監護病房（ICU）的膿毒癥患者的診斷敏感性為81%，特異性為76%，聯合雙相APTT和PCT檢測不能增加診斷敏感性，但可增加診斷特異性達94%，在ICU的全身炎癥反應綜合征患者組中，雙相APTT可識別出病死率增加的一組，出現BPW的患者組的病死率高于未出現BPW的患者組，雙相APTT的應用不僅局限于ICU患者，非ICU患者的BPW與陽性血培養結果相關[16]。Hussain等[17]研究顯示，雙相APTT能夠在特定高風險的患者中識別膿毒癥患者。Matsumoto等[18]發現盡管雙相APTT診斷DIC的特異性為95.4%，但敏感性僅為59.2%。因此，BPW可能僅僅作為各類感染的標志，而BPW與DIC高風險的一致性可能僅見于嚴重的膿毒癥患者中[16]。BPW現象的潛在機制與凝血活化導致的DIC有關，特別是vLDL微粒中包含著負電荷的磷脂，這是與凝血因子形成復合物的基礎。這些磷脂使vLDL微粒具有促凝作用，同時也可在血小板活化過程中轉移至血小板[19]。盡管生理水平的vLDL促凝效果已經被發現，但vLDL微粒在高濃度時是否與促凝有關尚待研究。雙相APTT已經顯示出其對DIC患者不良預后的預警價值。

4 燒傷與膿毒癥

盡管燒傷后存活率已經上升，但病死率依然很高。凝血紊亂已經被證明是增加燒傷后發病率和病死率的危險因素，但其確切的病理機制尚未完全闡明。在凝血病理過程的早期階段，纖維蛋白（原）水平顯著增高，提示患者存在高凝狀態，由于燒傷后早期階段的消耗，抗凝血系統的相關蛋白（抗凝血酶、蛋白C等）明顯下降，而補充液體治療導致的稀釋也可能是降低的原因，此外由于抗凝血酶（antithrombin，AT）的減少，導致凝血因子的活性增加[20]。在燒傷后的早期階段，AT活性的降低可由多種機制誘導并會造成多種不良的結果，其中膿毒癥的作用是顯著的。在燒傷時診斷膿毒癥是較為困難的。Barati等[21]研究顯示，膿毒癥患者的PCT顯著增高，CRP、白細胞計數（WBC）、中性粒細胞和紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）則未發生顯著改變。死亡患者的血漿PCT顯著高于存活的患者，PCT水平對于診斷燒傷后合并的嚴重感染以及評估不良預后是有效的，其他參數應用價值則較低[22]。

動物實驗結果顯示，補充AT不僅有抗凝的功能，而且具有免疫調節的效果，可以削弱T細胞反應和炎癥過程，此外補充AT對燒傷后肺部的指標存在明顯有益的影響,該動物模型中再現了AT補充治療，同時應用肝素無法實現同樣的效果,此研究重復性地提示了燒傷后早期階段的低水平AT現象和應用AT的臨床優勢，抗凝治療對于減輕燒傷和煙吸入性損害是有效的[23]。Lavrentieva等[24]研究顯示，在燒傷后早期階段應用AT補充治療可以降低發病率和病死率。DIC的高發病率和病死率是重癥燒傷患者常見的現象，其間的關聯是明顯的。但目前所有研究中存在的不足是沒有達到必須的觀察例數，從而影響了結論的說服力。但在燒傷后的早期階段進行AT治療，可能改變患者凝血系統的功能狀態，并且減輕了器官衰竭的程度以及降低病死率。

5 新生兒膿毒癥的實驗室監測

在發展中國家，每年會有大約160萬新生兒死于感染，其中多數是膿毒癥和腦膜炎[25]。Walliullah等[26]發現微量紅細胞沉降率以及未成熟粒細胞與白細胞數量之間的比率(imma?ture and total neutrophil ratio，I/T)對早期診斷新生兒敗血癥有意義。另一些研究采用白細胞計數、CRP、白細胞介素-6（in?terleukin-6，IL-6）、TNF-α等指標對新生兒膿毒癥晚期進行獨立或聯合評價，結果顯示，膿毒癥組和疑似膿毒癥組患者的CRP和IL-6水平顯著增高，TNF-α水平僅在膿毒癥組中顯示出異常，IL-6、TNF-α與CRP的診斷符合率相近，均優于白細胞計數，并與患者病情及預后相關，多參數的聯合評價并不能增加診斷的有效性[27]。由于在健康的生理條件下，IL-6低水平表達，當機體發生感染、創傷或其他應激狀態時，內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞會在病毒或細菌內毒素的誘導下迅速顯著表達IL-6，同時大量釋放的還包括TNF-α等細胞因子。因此，IL-6和TNF-α水平變化能夠有助于對膿毒癥的診斷，并可監測膿毒癥時內皮細胞的損傷或功能異常。當CRP和白細胞計數連續進行監測時，其聯合評價可增高診斷的準確性。

隨著對膿毒癥患者止凝血各系統功能的深入研究，將有新的指標被應用與評估，更多的指標間聯合評價方法將會出現，使臨床和實驗室對于患者發生DIC的早期預警和對預后評價能力逐漸增強，兒童和新生兒的膿毒癥早期預警也開始引起研究者更多的注意。此外，對于血管內皮、血小板和凝血系統的基礎研究會進一步成為重點，血管內皮細胞的損傷可能會成為許多研究的核心內容，其中血小板與內皮損傷之間的機制最有可能出現突破性進展。近期的研究表明，局部和全身性感染的免疫應答依賴于細胞內外的模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs），在此過程中，內皮細胞TLRs的角色已經明確[28]，而血管內皮細胞NOD樣受體（NOD-like receptors，NLRs）同樣參與了感染時的免疫防御應答[29]。從長遠看，對于細胞內外PRRs和下游信號分子作用機制的干預研究將可能促進新的治療策略的出現，并為將來對DIC和多器官衰竭的防治提供理論依據。

[1]Gando S,Iba T,Eguchi Y,et al.A multicenter,prospective valida?tion of disseminated intravascular coagulation diagnostic criteria for critically ill patients:comparing current criteria[J].Crit Care Med, 2006,34（3）:625-631.

[2]Wada H.Disseminated intravascular coagulation[J].Clin Chim Acta, 2004,344（1-2）:13-21.

[3]Kushimoto S,Gando S,Saitoh D,et al.Clinical course and outcome of disseminated intravascular coagulation diagnosed by Japanese Association for Acute Medicine criteria:Comparison between sepsis and trauma[J].Thromb Haemost,2008,100（6）:1099-1105.

[4]Wada H,Hatada T.Difference between sepsis and trauma diag?nosed as sensitive diagnostic criteria for disseminated intravascular coagulation[J].Thromb Haemost，2008，100（6）:958-959.

[5]Toh CH,Hoots WK.The scoring system of the Scientific and Stan?dardisation Committee on Disseminated Intravascular Coagulation of the International Society on Thrombosis and Haemostasis:a 5-year overview[J].J Thromb Haemost,2007,5（3）:604-606.

[6]Hess JR,Lawson JH.The coagulopathy of trauma versus disseminat?ed intravascular coagulation[J].J Trauma,2006,60（6 Suppl）: S12-19.

[7]Aslam R,Speck ER,Kim M,et al.Transfusion-related immunomod?ulation by platelets is dependent on their expression of MHC ClassⅠ molecules and is independent of white cells[J].Transfusion, 2008,48（9）:1778-1786.

[8]Semple JW,Aslam R,Kim M,et al.Platelet-bound lipopolysaccha?ride enhances Fc receptor-mediated phagocytosis of IgG opsonized platelets[J].Blood,2007,109（11）:4803-4805.

[9]Kuckleburg CJ,Tiwari R,Czuprynski CJ.Endothelial cell apoptosis induced by bacteria-activated platelets requires caspase-8 and-9 and generation of reactive oxygen species[J].Thromb Haemost，2008，99（2）:363-372.

[10]Semple JW.Platelets play a direct role in sepsis-associated endothe?lial cell death[J].Thromb Haemost，2008，99（2）:249.

[11]Rizvi M,Pathak D,Freedman JE,et al.CD40-CD40 ligand interac?tions in oxidative stress,inflammation and vascular disease[J]. Trends Mol Med，2008，14（12）:530-538.

[12]Kuckleburg CJ,Tiwari R,Czuprynski CJ.Endothelial cell apoptosis induced by bacteria-activated platelets requires caspase-8 and-9 and generation of reactive oxygen species[J].Thromb Haemost, 2008,99（2）:363-372.

[13]Downey C,Kazmi R,Toh CH.Novel and diagnostically applicable in?formation from optical waveform analysis of blood coagulation in dis?seminated intravascular coagulation[J].Br J Haematol，1997，98（1）: 68-73.

[14]Toh CH,Samis J,Downey C,et al.Biphasic transmittance waveform in the APTT coagulation assay is due to the formation of a Ca (++)-dependent complex of C-reactive protein with very-low-den?sity lipoprotein and is a novel marker of impending disseminated in?travascular coagulation[J].Blood,2002,100（7）:2522-2529.

[15]Chopin N,Floccard B,Sobas F,et al.Activated partial thromboplas?tin time waveform analysis:a new tool to detect infection[J]?Crit Care Med,2006,34（6）:1654-1660.

[16]Zakariah AN,Cozzi SM,Van Nuffelen M,et al.Combination of bi?phasic transmittance waveform with blood procalcitonin levels for diagnosis of sepsis in acutely ill patients[J].Crit Care Med,2008,36（5）:1507-1512.

[17]Hussain N,Hodson D,Marcus R,et al.The Biphasic Transmittance Waveform:An early maker of sepsis in patients with neutropenia[J]. Thromb Haemost，2008，100（1）:146-148.

[18]Matsumoto T,Matsumoto T,Wada H,et al.Frequency of abnormal biphasic aPTT clot waveforms in patients with underlying disorders associated with disseminated intravascular coagulation[J].Clin Ap?pl Thromb Hemost，2006，12（2）:185-192.

[19]Ibrahim S,Djimet-Baboun A,Pruneta-Deloche V,et al.Transfer of very low density lipoprotein-associated phospholipids to activated human platelets[J].J Lipid Res，2006，47（3）:341-348.

[20]Lavrentieva A,Kontakiotis T,Bitzani M,et al.Early coagulation dis?orders after severe burn injury:impact on mortality[J].Int Care Med，2008，34（4）:700-706.

[21]Barati M,Alinejad F,Bahar MA,et al.Comparison of WBC,ESR, CRP and PCT serum levels in septic and non-septic burn cases[J]. Burns，2008，34（6）:770-774.

[22]Grieb G,Simons D,Piatkowski A,et al.Macrophage migration inhib?itory factor-A potential diagnostic tool in severe burn injuries[J]? Burns，2010，36（3）:335-342.

[23]Enkhbaatar P,Esechie A,Wang J,et al.Combined anticoagulants ameliorate acute lung injury in sheep after burn and smoke inhala?tion[J].Clin Sci，2008，114（4）:321-329.

[24]Lavrentieva A,Kontakiotis T,Bitzani M,et al.The efficacy of anti?thrombin administration in the acute phase of burn injury[J]. Thromb Haemost，2008，100（2）:286-290.

[25]Qazi SA,Stoll BJ.Neonatal sepsis:a major global public health chal?lenge[J].Pediatr Infect Dis J，2009，28（1）:S1-2.

[26]Walliullah SM,Islam MN,Siddika M,et al.Role of Micro-ESR and I/T Ratio in the Early Diagnosis of Neonatal Sepsis[J].Mymensingh Med J，2009，18（1）:56-61.

[27]Schuett H,Luchtefeld M,Grothusen C,et al.How much is too much?Interleukin-6 and itssignallingin atherosclerosis[J]. Thromb Haemost，2009，102（2）:215-222.

[28]Shibamiya A,Hersemeyer K,Schmidt W?ll T,et al.A key role for Toll-like receptor-3 in disrupting the hemostasis balance on endo? thelial cells[J].Blood，2009，113（3）:714-722.

[29]Martinon F,Mayor A,Tschopp J.The inflammasomes:guardians of the body[J].Annu Rev Immunol，2009，27:229-265.