孕酮干預(yù)對缺氧缺血性腦損傷新生鼠腦組織膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的影響*

王小引 李曉娟 李東亮 郭學(xué)鵬

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic en?cephalopathy，HIE）是由于圍產(chǎn)期缺氧缺血引起胎兒、新生兒的腦損傷所致，是引起兒童神經(jīng)系統(tǒng)慢性傷殘的常見原因，已成為研究的熱點(diǎn)[1]。孕酮（progesterone）在缺氧缺血腦損傷（hypoxicischemic brain damage，HIBD）發(fā)病過程中起著保護(hù)腦組織的作用，可拮抗自由基的產(chǎn)生和抑制細(xì)胞凋亡等[2]，但這些研究多集中在神經(jīng)細(xì)胞方面，對膠質(zhì)細(xì)胞影響的研究不多，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化和RT-PCR技術(shù)研究孕酮對新生鼠HIBD腦組織中膠質(zhì)纖維酸性蛋白（gial fibrillary acidic protein，GFAP）表達(dá)的影響，旨在從分子水平探討孕酮對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 7日齡Wistar大鼠24只。雌雄不拘，體質(zhì)量12～18 g，平均（14.58±3.29）g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。總RNA提取試劑盒和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Takara公司，引物均由上海生物工程有限公司合成。α-actin、GFAP一抗、即用型鏈霉親和素-生物素-酶復(fù)合物（strept avidin-biotin com?plex，SABC）免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物工程有限公司。

1.2 造模與分組 24只大鼠隨機(jī)分成3組，每組8只。假手術(shù)組平均體質(zhì)量（14.06±1.36）g，僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，做頸部切口，不結(jié)扎，不做缺血缺氧處理；缺氧缺血組平均體質(zhì)量（14.83±1.78）g，行缺氧缺血處理；藥物預(yù)防組平均體質(zhì)量（14.90±1.67）g，行缺氧缺血處理且在缺氧前30 min按8 mg/kg腹腔注射濃度為0.5 g/L的孕酮溶液。各組間體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.54，P＞0.05）。其中，缺氧缺血組和藥物預(yù)防組新生大鼠參照參考文獻(xiàn)[3]處理，用無水乙醚麻醉后，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，絲線結(jié)扎，置于37℃恒溫的密閉容器中，以1.5 L/min通入80 mL/L氧氣和920 mL/L氮?dú)獾幕旌蠚怏w2.5 h，制備缺氧缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀δＰ椭苽浜? h內(nèi)沒有出現(xiàn)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的動(dòng)物給予剔除。本研究全部造模成功。

1.3 檢測指標(biāo) （1）免疫組化檢測各組腦組織GFAP的表達(dá)：缺氧缺血組和藥物預(yù)防組于HIBD后24 h處死，假手術(shù)組同時(shí)處死，迅速取腦，常規(guī)方法進(jìn)行固定、脫水、透明、包埋、切片及烤片，GFAP免疫組織化學(xué)染色按試劑使用說明進(jìn)行。GFAP蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的胞漿和胞核呈棕黃色，計(jì)數(shù)方法：在400倍光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)皮質(zhì)6個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)GFAP染色陽性細(xì)胞，以平均值作為陽性細(xì)胞數(shù)。（2）RT-PCR檢測各組腦組織GFAP mRNA的表達(dá)：采用總RNA提取試劑盒從大鼠的腦組織中提取總RNA，并用Takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR檢測GFAP mRNA的表達(dá)，β-actin為內(nèi)參，上游引物5′-CGTTGACATCC GTAAAGACC-3′，下游引物5′-GCTAGGAGCCAGGGCAGTA-3′，產(chǎn)物長度280 bp。GFAP上游引物5′-CGTTGACATCCGTA AAGACC-3′，下游引物5′-GCTAGGAGCCAGGGCAGTA-3′，產(chǎn)物長度488bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，Bander leader 3.0凝膠圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析，GFAP與β-actin的產(chǎn)物條帶灰度值之比作為反映目的基因mRNA水平的相對指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，成組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用LSD-t法，方差不齊者采用Dunnett′ s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠GFAP表達(dá)的變化 假手術(shù)組GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體瘦小且細(xì)胞數(shù)目很少，突起細(xì)短，散在分布；缺氧缺血組GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體肥大、增粗、突起增多，細(xì)胞數(shù)目明顯增多；藥物預(yù)防組GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞也較多，胞體較大，突起較多，見圖1。

2.2 各組GFAP及GFAP mRNA表達(dá)的變化 GFAP mRNA及GFAP陽性細(xì)胞數(shù)在各組大鼠中的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2、表1。

圖2 各組大鼠GFAP mRNA的表達(dá)

表1 各組大鼠GFAP及GFAP mRNA表達(dá)表達(dá)比較（±s）

表1 各組大鼠GFAP及GFAP mRNA表達(dá)表達(dá)比較（±s）

＊＊P＜0.01

組別 n GFAP陽性細(xì)胞（個(gè)）GFAP mRNA表達(dá)假手術(shù)組（1）缺氧缺血組（2）藥物預(yù)防組（3）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）888 3.23±1.46 25.52±2.67 15.49±3.72 60.23＊＊＜0.001＜0.001 0.002 0.20±0.13 0.89±0.34 0.52±0.19 45.78＊＊＜0.001 0.004 0.005

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)中，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量為神經(jīng)細(xì)胞的10～50倍，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，Ast）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的膠質(zhì)細(xì)胞，約占腦總體積的50%，數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了神經(jīng)元[4-5]。其在血管、室管膜、軟腦膜周圍形成一個(gè)“屏障”，將神經(jīng)元與外界環(huán)境隔開，其胞質(zhì)的突起也緊密地圍繞于突觸復(fù)合體及郎飛節(jié)周圍。Ast可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外離子濃度、pH值、維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、調(diào)節(jié)滲透壓、供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物、形成和維持血腦屏障、清除氧自由基、攝取神經(jīng)遞質(zhì)、參與炎癥和免疫反應(yīng)，具有吞噬、神經(jīng)營養(yǎng)等方面的作用，在神經(jīng)元發(fā)育過程中指導(dǎo)其遷移，調(diào)控突觸形成及突觸傳遞，并在神經(jīng)元損傷后的可塑性和再生方面起著重要作用。腦缺氧缺血后，Ast的分布、形態(tài)和數(shù)量以及生物功能等方面都將發(fā)生變化[4-5]。

本研究結(jié)果顯示，腦缺氧缺血損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，GFAP表達(dá)增加，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]。腦缺氧缺血后，常誘發(fā)Ast激活并活化。Ast作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血后第一個(gè)受損細(xì)胞，在腦缺血幾秒鐘后即開始肥大，隨著缺血的連續(xù)刺激，出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，隨后出現(xiàn)細(xì)胞增殖，在梗死灶、梗死灶周圍出現(xiàn)大量反應(yīng)性Ast，又稱為Ast的活化，活化的Ast一方面表現(xiàn)為胞體肥大，胞漿增多，嗜酸性，突起增粗、分支增多[5-6]；另一方面相關(guān)蛋白表達(dá)的增加，波形蛋白、GFAP是Ast的特異性標(biāo)記物，在活化的Ast中顯著表達(dá)，常用來鑒別中樞神經(jīng)系統(tǒng)中損傷區(qū)和未受損區(qū)的星形膠質(zhì)反應(yīng)性。其中GFAP為Ast特有的細(xì)胞骨架蛋白，在缺血缺氧后的反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞中尤為明顯，因此，GFAP被公認(rèn)為Ast活化的一種特異性標(biāo)志蛋白，GFAP增加意味著Ast的活化,活化的Ast可通過合成多種蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子對神經(jīng)元起保護(hù)或毒性作用，對缺血性腦損傷的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸具有重要意義[7]。一方面其自身分泌大量神經(jīng)營養(yǎng)因子對腦組織損傷起著潛在的保護(hù)作用；另一方面亦可因過度增生形成膠質(zhì)瘢痕，影響神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)，導(dǎo)致多種神經(jīng)毒性作用產(chǎn)生。

目前有研究認(rèn)為，腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)增加，其早期以保護(hù)神經(jīng)組織為主，晚期則以促進(jìn)膠質(zhì)瘢痕形成，阻礙神經(jīng)再生為主[8]。本實(shí)驗(yàn)中PT-PCR和免疫組化的研究結(jié)果提示，孕酮在缺氧缺血性腦損傷24 h后可能通過干預(yù)反應(yīng)性Ast GFAP的表達(dá)，抑制Ast的過度活化、增生與腫脹以及隨之發(fā)生的Ast死亡。研究表明Ast的腫脹及死亡會(huì)造成血腦屏障功能的破壞[8]。本結(jié)果表明，孕酮可以明顯減少反應(yīng)性Ast缺氧缺血24 h的增生程度，且Ast沒有過度活化，故其充分發(fā)揮了對細(xì)胞間液谷氨酸（Glu）的吸收和轉(zhuǎn)化以及K+的緩沖作用，減少了向細(xì)胞間液Glu的釋放；并抑制缺氧缺血后膠質(zhì)細(xì)胞分泌一些對神經(jīng)元及其他膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用的物質(zhì)[5]，這可能就是孕酮對神經(jīng)元保護(hù)作用的機(jī)制。因此，孕酮對于治療腦血管疾病有著良好的應(yīng)用前景，對其神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制的研究，將為臨床上預(yù)防和治療缺血性腦血管病提供更有效的途徑。

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