升陷湯加味方對兔病態竇房結綜合征影響的實驗研究*

張 軍，劉玉潔，吉 麗，管建存，程 菲，張 倩

病態竇房結綜合征(Sick sinus syndrome，SSS)是由于竇房結及其鄰近組織器質性病變引起的竇房結起搏功能和(或)傳導障礙，從而產生多種心律失常和臨床癥狀的綜合征，屬心血管系統常見性、難治性疾病。我們在長期臨床實踐中，依據病態竇房結綜合征臨床表現，結合中醫學理論及古代醫家思想，組成升陷湯加味方治療本病并取得了顯著療效。本實驗擬通過升陷湯加味方預處理對兔病態竇房結綜合征模型的影響來探討其作用機制，為升陷湯加味方治療病態竇房結綜合征提供理論依據。

1 材料

1.1 動物

日本大耳白兔30只，華北煤炭醫學院動物實驗中心提供，體重2.5 kg～3.5kg，雌雄不拘，許可證SCXK(京)2007-0003。實驗前實驗性飼養5d。

1.2 試劑

25%烏拉坦，20%甲醛溶液，冰醋酸(分析純)，Na+-K+ATP酶測試盒、SOD測試盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，4%多聚甲醛、梯度酒精(60%、70%、80%、90%、95%、1 00%)、香柏油、二甲苯、固體石蠟、蘇木素染液、伊紅染液。

1.3 主要儀器

BL－420生物機能實驗系統(成都泰盟)，針形四極心電電極，自制棉簽(2mm×2mm×3mm左右)，動物人工呼吸機DH－140(浙江醫科大學儀器實驗廠)，FA2004電子天平(上海天平儀器廠)，組織勻漿機(IKA-T8:Germany)，80-2離心沉淀器(江蘇省金壇市醫療儀器廠)，SHZ-88水浴恒溫振蕩器(常州翔天實驗儀器廠)，722S可見分光光度計(上海精密儀器有限公司)，切片機和光學顯微鏡。

1.4 藥物

升陷湯加味方組成:黃芪 30g，知母 10g，柴胡6g，桔梗 10g，升麻 6g，黨參 18g，山萸肉 20g，桂枝10g，炙甘草10g，羌活10g。采用廣東一方制藥有限公司生產的顆粒劑(相當于上述藥物原生藥飲片劑量);心寶丸(60mg/丸，星辰牌，廣東真和新君寶藥業有限公司)。

2 方法

2.1 分組、給藥與造模

2.1.1 分組 將30只日本大耳白兔隨機分成空白組(A組)、模型組(B組)、心寶對照組(C組)、升陷湯加味方高劑量組(D組)、升陷湯加味方中劑量組(E)、升陷湯加味方低劑量組(F組)6組，每組5只。

2.1.2 給藥 每組于造模前先連續給藥7d，每天1次，藥物預處理組給藥劑量按人與兔用藥量換算方法［1］得出:A組:經口灌服蒸餾水15ml/d×7d;B組:經口灌服蒸餾水15ml/d×7d;C組:經口灌服心寶混懸液0.18g/kg.d×7d(與蒸餾水15ml/d制成混懸液);D組:經口灌服升陷湯加味方顆粒劑86.2g/kg.d×7d(溶于15ml/d蒸餾水);E組:經口灌服升陷湯加味方顆粒劑43.1g/kg.d×7d(溶于15ml/d蒸餾水);F組:經口灌服升陷湯加味方顆粒劑21.5g/kg.d×7d(溶于15ml/d蒸餾水);每組給藥7d后進行模型制備手術。

2.1.3 模型制備 取健康大耳白兔30只，稱重后用25%烏拉坦(1g/kg)經耳緣靜脈麻醉，背位固定于動物手術臺上，連接BL－420生物機能實驗系統。頸部及胸前剪毛，消毒手術區。頸部氣管切開備用連接呼吸機，沿胸骨右緣縱向切開皮膚長約2cm，打開胸腔，避免損傷右側胸膜，經縱隔打開心包，充分暴露心臟。持續心電、呼吸監護。實驗組用20%甲醛溶液浸濕大小約2mm×2mm×3mm棉簽并置于竇房結區(上腔靜脈與右心房交界處)［2］濕敷，連續監測心電圖變化并記錄其HR。空白組只行開胸手術，不行甲醛濕敷手術。以濕敷后HR較濕敷前下降30%以上或出現竇性停搏、竇房阻滯及(或)結性逸搏心律為竇房結組織急性損傷模型成功的標志［3］。當出現上述現象時即停止濕敷，對未出現上述現象者再持續濕敷5min，直到出現為止。

2.2 指標測定

2.2.1 心率的測定 記錄造模前、模型制備成功后 5min、30min、60min、120min 基礎竇性心率變化情況及空白組實驗過程中相應各時間點的心率。

2.2.2 竇房結功能測定 竇房結恢復時間(SNRT)的測定:采用分級遞增刺激法，以略大于基礎心率的頻率開始，之后以每次心率遞增20%的頻率分級刺激，直至SNRT不再延長為止。刺激時間為30s，間隔1min，刺激強度為2倍舒張域，脈寬0.3ms。計算方法:將心房刺激終止前的最后1個 P波至第1個恢復后的竇性P波時間為竇房結恢復時間，不論哪一個刺激頻率水平，取其最大值作為每只兔的竇房結恢復時間。校正竇房結恢復時間(SNRTc)測定:SNRTc=SNRT－基礎竇性周期長度(BCL)。竇房傳導時間(SACT)測定:采用 Narula法［4］以大于基礎心率10%的頻率刺激右心房，連續8次，刺激強度、脈寬同 SNRT測定。計算方法:SACT=(刺激后恢復間期－基礎竇性周期長度)/2。

2.2.3 心肌Na+-K+ATP酶測定 各組造模成功后2h，剪取心肌組織，迅速置于冰鹽水中反復沖洗，濾紙吸干水分，準確稱重0.2g，加入組織重量9倍的冰鹽水，使用組織勻漿機1000r/min制成10%組織勻漿，1000r/min離心，取上清200μl用鹽水按1∶4稀釋成2%的組織勻漿，按試劑盒說明測定蛋白含量和Na+-K+ATP酶活力。

2.2.4 心肌SOD活力測定 取材及制備同Na+-K+ATP酶測定，取上清采用黃嘌呤氧化酶法，嚴格按試劑盒說明測定蛋白含量及SOD活力

2.2.5 竇房結病理切片觀察 實驗結束后剪取竇房結制作切片，光學顯微鏡觀察各組竇房結組織損傷情況。

2.5 統計學處理

使用SPSS13.0統計軟件，定量資料以均數±標準差(珋x±s)表示，多組間均數比較做單因素方差分析，重復測量數據采用重復測量資料方差分析，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組心率的變化情況

表1 各組心率的變化情況(珋x±s)(次/min)

表1顯示，造模前與造模后比較(除A組外)，各組心率均下降30%以下(P<0.05)，且于60min、120min時趨于穩定，表明造模成功;與A組比較，B組、C組、D組、E組、F組造模后各時間點心率均下降(P<0.05);與B組比較，C組、D組、E組、F組造模后各時間點心率均上升(P<0.05);與C組比較，D組造模后各時間點心率下降不明顯(P>0.1)，差異無統計學意義，E組、F組變化明顯(P<0.05)。

3.3 各組心肌Na+-K+ATP酶活力、SOD活力的變化

表3 各組心肌Na+-K+ATP酶活力SOD活力的變化

3.2 各組竇房結電生理功能各項指標變化

表2 各組竇房結電生理功能各項指標變化(珋x±s)

表3顯示，與A組比較，其余各組 Na+-K+ATP酶、SOD活力均顯著降低(P<0.05);與 B組比較，C組、D組、E組、F組 Na+-K+ATP酶、SOD活力均升高(P<0.05);與C組比較，D組Na+-K+ATP酶、SOD活力變化不明顯(P>0.1)，差異無統計學意義，而E組、F組變化顯著(P<0.05)。

3.4 竇房結病理切片觀察

表2顯示，與A組比較，其余各組各項電生理時間均顯著延長(P<0.05);與 B組比較，C組、D組、E組、F組各項電生理時間亦均顯著縮短(P<0.05);與C組比較，D組各項電生理時間變化不顯著(P>0.1)，差異無統計學意義，E組、F組各項電生理時間亦延長(P<0.05)。

觀察結果顯示，低倍鏡(×100)下模型組及各用藥組細胞腫脹，發生混濁變性，可見細胞排列紊亂，各組比較無明顯差異。高倍鏡下(×400)可見，細胞局灶性壞死，成纖維細胞增生，細胞排列紊亂。模型組大部分細胞都發生腫脹，細胞輪廓模糊，粒細胞浸潤，部分細胞壞死，P、T細胞明顯減少;用藥組少量細胞腫脹，細胞輪廓模糊，P、T細胞數量較模型組多。

4 結果

4.1 升陷湯加味方具有提高兔病竇綜合征模型心率的作用

觀察實驗組各時間點心率，與模型組比較，心寶組、升陷湯加味方高、中、低劑量組心率均顯著上升。結果表明，心寶及升陷湯加味方均能提高和改善心率，而升陷湯加味方高劑量組較心寶組心率下降不顯著(P>0.1)，中、低劑量組下降顯著(P<0.05)，說明升陷湯加味方高劑量能提高心率，效果與心寶相當，且有劑量依賴關系。

4.2 升陷湯加味方可保護竇房結電生理功能

實驗各組在造模后 SNRT、SACT、SNRTc與空白組比較均有延長(P<0.05)，表明各組因甲醛濕敷而造成竇房結功能不同程度的受損。實驗結果顯示，與模型組比較，各用藥組SNRT、SNRTc、SACT均顯著縮短，表明心寶及升陷湯加味方均能改善受損竇房結的自律性及其傳導功能;與心寶組相比，升陷湯加味方高劑量組 SNRT、SNRTc、SACT略有延長(P>0.1)，而中、低劑量組延長顯著(P<0.05)，提示升陷湯加味方高劑量具有與心寶相媲美的增強受損竇房結自律性及其傳導功能的作用，亦說明其作用與劑量相關。

4.3 升陷湯加味方可提高兔病態竇房結綜合征心肌Na+-K+ATP酶活力

Na+-K+ATP酶是細胞膜上普遍存在的一種離子驅動泵，在水解ATP的同時，能對抗細胞膜兩側電——化學梯度，維持膜內外 Na+、K+的濃度差［5］，在維持細胞的生理活動、細胞正常代謝及細胞內外離子平衡中起著重要作用。病態竇房結綜合征患者常出現與心動過緩有關的心臟供血不足癥狀［6］，長時間心肌供血不足會導致心肌細胞膜受損，甚或不可逆性損傷。本實驗在造模成功后2h剪取心肌組織并測定Na+-K+ATP酶活力。研究結果顯示，與空白組相比，模型組、各用藥組Na+-K+ATP酶活力顯著降低，提示20%甲醛濕敷手術可能造成心肌細胞受損，各用藥組較模型組Na+-K+ATP酶活力均明顯升高，其中升陷湯加味方高劑量組與心寶組Na+-K+ATP酶活力相當，且高于升陷湯加味方中、低劑量組。此結果證實，升陷湯加味方確實能提高Na+-K+ATP酶活力，由此推斷升陷湯加味方可能具有減輕心肌細胞損傷、保護心肌的作用，其深入性機制仍需進一步探討。

4.4 升陷湯加味方可提高心肌SOD活力

心動過緩而致的心肌缺血缺氧，可產生氧自由基生成過多，使心肌受到損傷。SOD是體內清除氧自由基抗氧化酶系統的重要組成成分之一，它能清除超氧陰離子，阻斷脂質過氧化鏈反應，保護細胞免受損傷［7］。SOD活性越高則清除超氧陰離子及抗氧化能力越強，保護的效果越顯著。實驗結果表明，與空白組比較，其余各組SOD活力均顯著降低，表明心肌受損;與模型組比較，心寶組、升陷湯加味方高、中、低劑量組SOD活力顯著升高，說明各用藥組心肌具有自我保護能力;與心寶組相比，升陷湯加味方高劑量組SOD變化不顯著，中、低劑量組SOD活力明顯不及心寶組，因此升陷湯加味方高劑量具有更好的心肌保護效應。

4.5 升陷湯加味方可保護竇房結細胞形態結構

竇房結病理切片顯示，模型組發生大量細胞腫脹，細胞輪廓模糊，粒細胞浸潤，部分細胞壞死，P、T細胞明顯減少;各用藥組少數細胞腫脹，細胞輪廓模糊，P、T細胞減少數量較模型組少，表明用20%甲醛濕敷竇房結可以成功造成竇房結損傷模型，亦表明升陷湯加味方能夠增強竇房結細胞抗損害的能力。

圖1 使用升陷湯加味方后竇房結病理切片

圖2 模型對照組竇房結病理切片

5 結論

病態竇房結綜合征臨床表現多為緩慢性心律失常，癥見心悸、氣短、胸悶、頭暈甚至昏厥等，觀其脈象常以遲緩為主，中醫將其歸屬于“心悸”、“眩暈”、“胸痹”、“厥證”、“脈遲癥”等范疇。根據多年的臨床實踐，我們認為本病的病機為大氣下陷、胸陽不振。《素問·陰陽應象大論》:“氣虛宜掣引之。”故大氣下陷證的治療當以升提胸中大氣、振奮心陽為主，因此以張錫純之升陷湯、張仲景的桂枝甘草湯作為基礎方加減化裁為升陷湯加味方。本動物實驗結果表明，升陷湯加味方預處理可提高兔病態竇房結綜合征模型的心率，保護竇房結功能，提高心肌SOD、Na+-K+ATP酶活力和竇房結細胞抗損害能力，其功效與劑量相關，高劑量效果更佳，為本藥的臨床應用提供了科學依據 。

［1］ 劉福英，等.實驗動物學［M］.北京:中國科學技術出版社，2005.209-210.

［2］ Boyett MR，Honjo H，Kodama I.The sinoatrial node，a heterogeneous pacemaker structure［J］.Cardiovasc Res，2000，47(4):658～687.

［3］ 耿乃至.復心脈方對病態竇房結綜合征家兔模型 HR、SNRT、SACT影響的實驗研究［D］.黑龍江中醫藥大學博士學位論文，2008.45.

［4］ Narula OS，Shantha N，Vasquez M，etal.A new meathod for measurement of sinoatrial conduction time.Circulation ，1978，58:706.

［5］ 徐桂芬，何英，等.參附注射液對緩慢性心律失常家兔心肌組織 Na+-K+ATP酶活性的影響［J］.中國中醫藥科技，2007，14(5):341-342.

［6］ 葉任高，陸再英.內科學［M］.北京:人民衛生出版社，2005.185.

［7］ 王迪潯，金惠銘主編.人體病理生理學［M］.北京:人民衛生出版社，2002.744-746.2.