不同模式低氧耐力訓練對大鼠肝組織HIF-1α、HO-1 m RNA表達的影響

徐建方，馮連世，路瑛麗，張 漓，王雪冰

低氧訓練的有關研究源于對高原訓練的探索，其基本原理在于利用低氧和訓練的雙重刺激，使機體產生一系列的適應性改變，以最大限度地發揮機體的運動潛能[1]。作為介導細胞低氧反應的核轉錄因子，低氧誘導因子-1α （HIF-1α）受低氧誘導，在機體低氧應答和低氧訓練適應性改變的過程中扮演著重要的角色。大量研究表明，涉及血管舒張、血管生成、細胞凋亡與增殖等方面的多種靶基因受 H IF-1α調控，如誘導型一氧化氮合酶（NOS）、血紅素加氧酶（HO）、血管生長因子（VEGF）等[5，7，14]。HO是催化血紅素生成膽綠素、鐵和CO的微粒體酶，HO-1為其亞基，在改善血流、提高機體應急能力和保護能力的過程中具有重要的作用[8，13]。

眾所周知，為滿足訓練需要，在運動訓練過程中，不可避免地存在著血液重新分配問題，本研究擬就高住高練、高住低練、低住高練3種不同低氧訓練模式對大鼠肝組織HIF-1α、HO-1mRNA表達的影響進行研究，探討低氧訓練時內臟器官的適應性變化。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

90只6周齡雄性SD大鼠，分籠飼養，每籠5只，室溫23℃～25℃，濕度40％～60％，自然光照，自由飲食。

1.2 訓練方式

90只實驗大鼠經適應性訓練篩選出60只，隨機分為6組，每組10只：1）常氧安靜組；2）低氧安靜組；3）低住低練組；4）高住高練組；5）高住低練組；6）低住高練組。所有訓練組采用水平動物跑臺進行耐力訓練（表1）。

表1 本研究動物實驗安排一覽表

1.3 實驗取材

安靜組4周末，運動組最后一次訓練恢復24 h，按0.3 m l/100 g體重劑量腹腔注射10％水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠，期間迅速分離出大鼠肝組織在預冷的生理鹽水中漂洗去血，濾紙吸干水分，放液氮中速凍，待測。

1.4 指標測試方法

1.4.1 主要試劑及儀器

MyLab通用型 RNA快速提取試劑盒（美萊博醫學科技有限公司，中國）；M-MuLV反轉錄酶：200u/μl，Fermentas（MBI公司，美國）；RNase Inhibitor：40u/μl，Fermentas （MBI，美國）；420×EvaGreen（Biotium，美國）；Takara TP600型梯度 PCR儀（Takara公司，日本）；SLAN雙通道熒光定量PCR儀（宏石醫療科技有限公司，中國）。

1.4.2 測試方法

1.肝組織總RNA提取：用MyLab通用型RNA快速提取試劑盒提取樣品 RNA，最后加入30μl無 RNase的水，溶解 RNA。用DNase I消化樣品 RNA中的DNA （表2）。

表2 DNA消化方法一覽表

2.RNA反轉錄為cDNA（表3）。

表3 反轉錄操作程序一覽表

3.引物設計：所有引物設計均為先通過互聯網從genebank查詢到各個目的mRNA原序列，選擇合適的序列范圍，再用p rimer 5引物設計軟件篩選出合適的引物，各引物序列如下：

β-actin：上游引物-GAAGTGTGACGTTGACATCCG，

下游引物GCCTAGAAGCATTTGCGGTG；

HIF-1α：上游引物CTTTCTTGGAAACGAGTGAAAGG，

下游引物TGAGTAATTCTTCACCCTGCAG；

HO-1：上游引物CAGACAGAGTTTCTTCGCCAG，

下游引物AGAGAGAAGGCTACATGAGACAG。

4.定量PCR檢測：取0.2μl薄壁 PCR管，分別編號，向各管中加入不含染料2×qPCR TaqMix 12.5μl，10μM各基因正反向引物混合物0.5μl，對應的cDNA各1μl，一管中不加模板用作陰性對照，各管補加水至25ml，混勻，置于SLAN熒光定量 PCR儀中。95℃5 min預變性后， 95℃15 s→65℃35 s（熒光檢測），40個循環。

1.5 數據統計

2 實驗結果

2.1 低氧訓練對肝組織 H IF1-αmRNA表達的影響

表4顯示，低氧安靜、低住低練、高住高練、高住低練和低住高練組較常氧安靜組，肝組織 HIF-1αmRNA表達均有非常顯著性的升高（P＜0.01），其中，高住高練和低氧安靜組升高最為明顯，分別達到866和802倍，高住低練、低住高練、低住低練組分別升高55、151和34倍。

與低住低練組相比，低氧安靜和高住高練組肝組織HIF-1αmRNA表達有非常顯著性的升高（分別為23.6和25.8倍，P＜0.01）；高住低練、低住高練組肝組織則無明顯變化。

高住高練組肝組織 H IF-1αmRNA表達較高住低練和低住高練組均有非常顯著升高（分別達15.7和5.7倍，P＜0.01）。

高住低練組、低住高練組肝組織 HIF-1αmRNA表達較低氧安靜組均有非常顯著性降低（下降達93.8％和76.3％，P＜0.01）。

2.2 低氧訓練對肝組織 HO-1 mRNA表達的影響

表5顯示，與常氧安靜對照組相比，高住低練組肝組織HO-1 mRNA表達顯著升高（P＜0.05）；低氧安靜、低住低練、高住高練和低住高練組肝組織 HO-1 mRNA表達均有非常顯著升高（分別達 551、322、875和 324倍，P＜ 0.01）。

與低住低練組相比，高住高練組肝組織 HO-1 mRNA表達顯著升高（2.7倍，P＜0.05）；高住低練、低住高練組則無明顯變化。

高住高練組肝組織HO-1 m RNA表達較高住低練組、低住高練組均有顯著升高（分別達 2.2和2.7倍，P＜ 0.05）。

表4 低氧訓練對大鼠肝組織HIF-1αm RNA表達的影響一覽表

表5 低氧訓練對大鼠肝組織HO-1 m RNA表達的影響一覽表

3 分析與討論

缺氧是對機體的異常刺激，機體通過特定的系統感受缺氧后，會發生一系列生理反應，如促紅細胞生成素（EPO）、內皮素-1（ET-1）、VEGF等表達增多，以維持功能，減少傷害。目前，關于缺氧感受信號傳遞的學說有：血紅素蛋白學說、NO和CO學說、NAD（P）H學說、線粒體學說和 HIF-1α感受氧學說等。低氧訓練作為運動訓練實踐中的輔助手段，對機體產生環境低氧和運動缺氧的雙重刺激，進一步誘導機體的適應性改變[15]。

3.1 低氧訓練對肝組織 H IF-lαmRNA表達的影響

HIF-1作為一種轉錄因子，低氧時廣泛分布于心、肝、腎、肺、腦、肌肉等許多組織細胞，是低氧反應基因（HRG）表達的生理性調控因子，可以被多種胞外刺激活化、上調，介導低氧反應，影響細胞存活、生長、分化以及凋亡等基因的表達。研究證實，H IF-1是調節氧穩態平衡的主要調節因子，在機體生理和病理過程中發揮重要作用。目前，發現40多個基因受其調控，涉及到血管生成、血管舒張、能量代謝、葡萄糖代謝、細胞增殖和細胞凋亡等[2，4]。

已有研究表明，H IF-1α在低氧訓練的適應過程中發揮重要作用，參與VEGF、iNOS、HO-1等mRNA表達的調控。Hoppeler發現，未經訓練的健康人在海拔3 850 m低氧環境下進行6周耐力訓練后，其骨骼肌 H IF-1αm RNA明顯上調，VEGF mRNA和肌紅蛋白mRNA表達也增加；而常氧狀態下則無顯著變化，研究提示低氧訓練導致 H IF-1α mRNA表達增加不依賴于運動訓練的強度[14]，這在趙鵬等的研究中也得到了證實。他們的研究發現，高住高練、高住低練和持續低氧安靜組骨骼肌 H IF-1α表達都明顯增強，而低住低練和低住高練變化不大，復氧訓練后回到常氧安靜水平，說明 H IF-1α表達與低氧（或缺氧）的程度和時間有明顯的依存關系[10]。劉文峰等研究發現，與安靜對照組相比，不論是單純低氧暴露、單純訓練，還是高住低練都能促進肝組織 HIF-1α的蛋白表達；高住低練過程中肝組織 H IF-1α蛋白表達高于單純低氧暴露或單純訓練方式，不同持續時間低氧后運動對大鼠肝組織 HIF-1α蛋白表達的影響不同[3]。

本研究發現，低氧安靜、低住低練、高住高練、高住低練和低住高練組肝組織 HIF-1αmRNA表達較常氧安靜組均有非常顯著性的升高（P＜0.01），其中，高住高練和低氧安靜組升高最為明顯分別達到866和802倍；而高住低練、低住高練、低住低練組則分別升高55、151和34倍，這提示，低氧和不同形式的運動均能影響機體肝組織 H IF-1αmRNA的表達。

與低住低練組相比，高住高練組肝組織HIF-1αmRNA表達有非常顯著性的升高（達25.8倍，P＜0.01）；而高住低練、低住高練組肝組織則無明顯變化。并且，高住高練組肝組織 H IF-1αm RNA表達較高住低練、低住高練組均有非常顯著升高（分別達15.7和5.7倍，P＜0.01）；而高住低練組、低住高練組肝組織 HIF-1αmRNA表達較低氧安靜組均有非常顯著性降低（下降達93.8％和76.3％，P＜0.01）。

以上結果顯示，單純低氧、單純訓練，以及不同模式低氧訓練都能明顯誘導肝組織 HIF-1αmRNA的表達；持續低氧對肝組織 HIF-1αmRNA表達的影響比間歇低氧更為明顯，表現為高住高練較高住低練、低住高練影響更顯著，提示低氧和訓練的雙重刺激對肝組織 HIF-1αmRNA表達產生更深刻的影響。

3.2 低氧訓練對肝組織 HO-1 mRNA表達的影響

HO是催化血紅素降解的始動酶和限速酶，生成膽綠素、鐵和CO。HO系統存在3種亞型蛋白，它們分別為誘導型HO-1和結構型 HO-2、HO-3。HO-1現已證明為人類熱應激蛋白（HSP32），生理狀態 HO-1表達是低水平的，但在各種刺激如血紅素、紫外線、缺氧、重金屬、細胞因子、炎癥因子等以及各種應激狀態后，其表達很快上調。HO-2是一種結構型基因，是生理狀態下 HO的主要存在形式。HO-3與HO-2有著約90％的同源性，但缺乏催化活性，其生物學特性和功能有待于進一步研究[8，16]。

多數研究結果表明，CO在細胞功能的調節中發揮著重要作用。特別是與運動能力緊密相關的心血管系統， CO通過激活sGC來誘導血管平滑肌的舒張，抑制血管平滑肌細胞增殖等作用；促進VEGF的合成；抑制血小板的黏附和聚集，調節血壓、改善主動脈血流等作用[6，9]。

另有研究表明，CO能提高機體的免疫保護能力，抑制多種因素引起的細胞凋亡，以及提高機體應激能力和自身保護能力。周君琳等報道，HO活性和CO生成量的增多可減輕大鼠肢體缺血再灌注所致的肺損傷[12]。

多數研究已經證實，H IF-1α對 HO-1的表達具有調節作用，主要通過作用于血管平滑肌細胞 HO-1基因，產生HO-1，催化產生CO。CO以氣體信使的身份激活鳥苷酸環化酶，從而實現生理功能[5，16]。

趙鵬等的研究表明，持續低氧和間歇低氧均有提高骨骼肌 HO-1 mRNA表達的趨勢，其中，高住高練和低住高練最有利于 HO-1表達增強；常氧安靜、間歇低氧安靜、低住低練和低住高練組骨骼肌 HO-1表達主要在細胞膜上，而持續低氧安靜、高住高練、低住高練、低氧訓練后復氧訓練組 HO-1表達卻主要在胞漿中[11]。

本研究發現，與常氧安靜對照組相比，高住低練組肝組織HO-1 mRNA表達顯著升高（P＜0.05）；低氧安靜、低住低練、高住高練和低住高練組肝組織 HO-1 mRNA表達則均有非常顯著升高（分別達551、322、875和324倍，P＜0.01）。

與低住低練組相比，高住高練組肝組織 HO-1 mRNA表達顯著升高（2.7倍，P＜0.05）；高住低練、低住高練組則無明顯變化；且高住高練組肝組織 HO-1 mRNA表達較高住低練組、低住高練組均有顯著升高（分別達2.2和2.7倍，P＜0.05）。

上述結果顯示，肝組織HO-1 mRNA的表達與 HIF-1α mRNA的表達有高度的一致性，單純低氧、單純訓練和不同模式低氧訓練均引起肝組織 HO-1 m RNA表達的升高；與低住低練相比，3種低氧訓練模式中，僅高住高練明顯影響肝組織HO-1 mRNA的表達，高住低練和低住高練無顯著影響。

4 結論

1.單純低氧、單純訓練和不同模式低氧訓練均能顯著提高肝組織H IF-1α、HO-1 m RNA的表達，有利于改善特殊情況下內臟器官的血液供應。

2.高住高練對肝組織 HIF-1α、HO-1 mRNA表達的影響較低住低練、高住低練和低住高練更為明顯，提示機體為應對雙重刺激，產生更為深刻的適應性反應。

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