普洱茶樣中“金花”微生物的分離鑒定

馬 燕 趙 明 周 玲 袁文俠 劉議聰 董燕梅 周紅杰

（云南農業大學普洱茶學院·昆明·650201）

一般認為“發花”是形成茯磚茶獨特品質的關鍵工藝，“發花”的實質是通過控制一定的外界條件，促使微生物優勢菌——冠突散囊菌（Eurotium cristatum）的生長繁殖，產生金黃色的閉囊殼，俗稱“金花”[1]。散囊菌可能產生纖維素酶等胞外酶催化茶葉化合物的轉化，能夠改善茶葉的品質，還可增加多種微生物代謝活性產物，豐富茶葉成分，增加保健功能，對茯磚品質形成起著重要作用[2]。

部分普洱茶樣品也發現有金黃色的小斑點，類似“金花”（圖1）。在市場銷售過程中，有的茶商直接認為金黃色的小斑點是與茯磚茶中相同的“金花”，而有的則認為不是金花，甚至可能是黃曲霉，因此需要進一步分離鑒定普洱茶中的這些微生物。本文對一個普洱茶樣中疑似“金花”的真菌微生物進行了分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗茶樣

“金花”普洱茶：普洱茶銷售人員送檢的普洱緊壓茶，樣品中有金黃色的小斑點（圖1），近似茯磚的“金花”。

發花用茶磚：實驗室自制的茶磚。

圖1 “金花”普洱茶樣品Figure 1 Pu-erh tea w ith“jinhua”

1.1.2 試劑

真菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒為上海華舜生物工程公司產品；Ex Taq酶和PCR相關試劑購自大連TaKaRa公司；其余試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 茶樣微生物分離

茶樣微生物分離按國標食品微生物學檢驗(GB 4789-2010)的方法進行。

1.2.2 微生物鑒定

菌落形態，霉菌：PDA培養基，三點接種，28℃，培養7d。

顯微結構，插片法與粘片法[3]。

1.2.3 分子生物學鑒定

應用真菌基因組DNA提取試劑盒(上海華舜生物工程公司產品)提取DNA，按說明書操作。應用引物 ITS4 （5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）擴增真菌核糖體RNA基因（即rDNA）的轉錄間隔區（Internal Transcribed Spacer,ITS）[4]，擴整體系按 Ex Taq 酶說明書進行。擴增程序：95℃，5min；（95℃30s，50℃ 30s，72℃ 30s）×40 個循環；72℃，5min。擴增產物委托上海英俊生物工程技術有限公司測序。將序列提交GenBank數據庫，利用BLASTn搜索同源序列，選取序列相近的2個GenBank收錄序列，用BioEdit軟件分析序列與GenBank收錄序列的相似性，鑒定菌株。

1.2.4 茶樣發花試驗

PDA斜面28℃培養7～14d，至菌株長出孢子，以滅菌蒸餾水洗滌，制備孢子懸液，血球計數板計數，稀釋至104個/mL，每塊茶磚分別接種5mL菌液，30℃保濕培養，15d觀察茶磚是否長出“金花”。

2 結果

2.1 茶樣微生物分離

應用國標方法分離茶樣中微生物，經平板劃線純化，根據菌落形態的差異共獲得4株真菌，分別編號01～04。

2.2 菌株的形態特征

各菌株經PDA平板培養（7d），菌落形態見圖2，形態描述見表1；經插片法或粘片法觀察，各菌落的顯微特征見圖3，顯微特征描述見表1。

表1 菌株01～04的菌落及顯微特征Table 1 The clone andm icroscopicmorphology ofstrain 01～04

圖2 菌株的菌落Figure 2 The clone ofstrain 01～04

圖3 菌株的顯微結構Figure 3 Them icroscopicmorphology ofstrain 01～04

2.3 菌株的分子生物學鑒定

擴增測序得到各菌株的ITS序列，Blastn比對分析，菌株01～04分別鑒定為塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）、傘枝犁頭霉 （Lichtheimia corymbifera）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）和黑附球菌 （Epicoccum nigrum）（表2）。將序列提交GenBank數據庫獲得序列登記號分別為：HQ728255～HQ728258。

表2 菌株01～04的Blastn比對結果Table 2 The results of Blastn of strain 01～04

2.4 茶樣發花試驗

茯磚茶中的“金花”主要是冠突散囊菌（Eurotium cristatum）的金黃色閉囊殼，試驗從普洱茶樣中分離鑒定出1株阿姆斯特丹散囊菌，推測該菌產生的閉囊殼可能是該普洱茶樣中的“金花”。為了驗證該推測，進行了普洱茶“發花”試驗。試驗結果顯示，接種阿姆斯特丹散囊菌的普洱茶出現了“金花”，與送檢“金花”普洱茶樣出現的黃色斑點相同（圖4）。

圖4 接種阿姆斯特丹散囊菌的普洱茶Figure 4 Pu-erh brick tea inoculated with Eurotium amstelodami.

3 討論

一般認為冠突散囊菌是茯磚中的優勢微生物，同時有些樣品存在其他散囊菌。王志剛等[5]從17份茯磚茶樣品中分離到冠突散囊菌、間型散囊菌、謝瓦散囊菌、匍匐散囊菌、散囊菌、赤散囊菌和一種散囊菌。散囊菌對茯磚茶的品質風味形成具有重要作用。本實驗從一普洱茶樣中檢出阿姆斯特丹散囊菌，感官審評該茶樣發現其茶湯紅潤、透明，有菌菇湯的滋味，推測阿姆斯特丹散囊菌可能增加了該普洱茶樣中某些氨基酸的含量。該“金花”普洱茶中氨基酸等化學成分含量的測定及比較有待進一步研究。本試驗證實通過接種該阿姆斯特丹散囊菌可以使普洱茶產生“金花”，為特色普洱茶的生產提供了實驗依據。

1 宛曉春.茶葉生物化學[M].北京:中國農業出版社,2003.

2 劉子音,許愛清,李宗軍,等.茯磚茶中冠突散囊菌及其代謝產物研究進展[J].茶葉通訊,2010,37(1):23～26.

3 黃秀梨.微生物學實驗指導[M].北京:高等教育出版社,1999.

4 N L Glass,G C Donaldson.Development of Primer Sets Designed for Use with the PCR To Amplify Conserved Genes from Filamentous Ascomycetes.Applied And EnvironmentalMicrobiology,1995,61(4):1323～1330

5 王志剛,童哲,程蘇云.茯磚茶中散囊菌的種類組成和鑒定[J].茶葉科學,1991,11(2):157～161.