Ki67、CyclinD1在食管鱗狀細胞癌中的表達及其意義

鄭發著 穆芳 張利 沈鴻彬

Ki67、CyclinD1在食管鱗狀細胞癌中的表達及其意義

鄭發著 穆芳 張利 沈鴻彬

目的探討Ki67、CyclinD1在食管鱗狀細胞癌中的表達意義及與食管鱗癌發生發展之間的關系。方法 應用流式細胞術方法(flow cytometry，FCM)檢測60例食管鱗狀細胞癌及食管正常組織中Ki67、CyclinD1蛋白的表達情況，并檢測食管癌組織中Ki67、CyclinD1蛋白表達與不同臨床參數之間的關系。FCM方法檢測食管癌組織中Ki67與CyclinD1蛋白表達的相關性。結果 流式細胞術方法檢測到食管癌組織中Ki67、CyclinD1蛋白表達水平顯著高于正常食管組織(P＜0.05)。食管癌組織中Ki67、CyclinD1蛋白表達水平與食管鱗癌細胞分化程度、有無淋巴結轉移、癌浸潤深度有關(P＜0.05)，與患者的性別及年齡無關(P＞0.05)。食管癌組織中Ki67與CyclinD1蛋白表達呈正相關性。結論 Ki67、CyclinD1蛋白在食管癌組織中的高表達可能參與了食管癌的發生與發展，其高表達使細胞具有旺盛增殖能力，促進腫瘤發生。聯合檢測Ki67、CyclinD1可作為食管癌診斷指標。

流式細胞術;食管鱗狀細胞癌;Ki67;CyclinD1

食管癌是較常見的惡性腫瘤，我國是食管癌的高發區，尤其在河北的磁縣和河南的林縣發病率較高，嚴重影響了人們的生命健康，目前食管癌的發病機制仍為闡明，研究食管癌發生、發展機制對食管癌早期診斷具有重要的意義。細胞周期的紊亂與腫瘤的發生具有密切的關系，Ki67及CyclinD1是細胞周期調控因子［1-4］，可以調控細胞周期從G1期向S期過渡，從而使細胞呈現旺盛增殖能力，促進腫瘤的發生［5，6］。本實驗主要研究食管癌組織中Ki67、CyclinD1表達意義及與食管癌發生、發展之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集河北醫科大學第四醫院2003年1月至2004年12月食管鱗狀細胞癌手術切除標本120例，所有患者術前未接受過化療和放療。每例標本分別取癌組織及手術切緣正常食管黏膜(距癌邊緣5 cm以上)。每個組織分為兩份，分別固定于4%多聚甲醛(用于HE病理診斷)和70%乙醇(用于流式細胞術檢測)。所有標本臨床病理資料完整，全部經病理檢查確診。從中選出60例食管鱗狀細胞癌(B組)和正常食管黏膜組織(A組)，用于FCM的檢測，男40例，女20例;年齡38～83歲，平均年齡(58±7)歲。食管鱗癌組織中45例為高中分化鱗癌，15例為低分化鱗癌;42例侵及纖維膜，18例未達到纖維膜;19例淋巴結轉移，41例未轉移。

1.2 主要試劑與儀器 流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司;鼠抗人Ki67、CyclinD1抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司;二抗為FITC標記的山羊抗鼠IgG，購自Jackson Immunoresearch Laboratiries Inc。

1.3 方法

1.3.1 實體組織單細胞懸液的制備:網搓法制備單細胞懸液，將細胞懸浮計數并調整細胞濃度為1×107/ml時，此懸浮液為單分散細胞懸液。

1.3.2 Ki67、CyclinD1蛋白的免疫熒光標記:取單細胞懸液0.1 ml(含1×106個細胞)，分別加入1∶100稀釋的鼠抗人Ki67、CyclinD1抗體0.1 ml，室溫放置30 min，加入PBS 10 ml洗滌一次，1 000轉，5 min低速離心，棄上清，分別加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液 100 μl，避光室溫放置 30 min，加入 PBS 10 ml 1 000轉，5 min低速離心，棄上清以除去未結合的熒光二抗，上機檢測前加入PBS 1.0 ml，經300目尼龍網過濾后上機檢測。

1.3.3 流式細胞術檢測蛋白表達方式:流式細胞術檢測Ki67、CyclinD1蛋白表達量以平均熒光強度(Mean Fluorescence Intensity)表示。

1.4統計學分析應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗分析，相關性分析采用Peason相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同食管組織中Ki67蛋白的表達情況 流式細胞術檢測結果顯示，Ki67蛋白在食管癌組織中的表達顯著高于食管正常組織(P ＜0.05)。見表1，圖1。

2.2 不同食管組織中CyclinD1蛋白的表達情況 流式細胞術檢測到CyclinD1蛋白在食管癌組織中的表達顯著高于食管正常組織(P ＜0.05)。見表2，圖2。

2.3 食管癌組織中Ki67、CyclinD1蛋白表達與臨床病理特征的關系 Ki67、CyclinD1蛋白表達量在低分化者、浸潤深度達到纖維膜者、有淋巴結轉移者顯著高于中高分化者、浸潤深度未達到纖維膜者、無淋巴結轉移者(P＜0.05)。年齡和性別之間表達量差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表1 流式細胞術檢測Ki67蛋白在不同食管組織中的表達

圖1 流式細胞術檢測不同食管組織中Ki67蛋白的表達

表2 流式細胞術檢測CyclinD1蛋白在不同食管組織中的表達n=60，±s

表2 流式細胞術檢測CyclinD1蛋白在不同食管組織中的表達n=60，±s

組別 CyclinD1 t值 P值A組368±26 B組401±29 6.511 0.000

圖2 流式細胞術檢測不同食管組織中CyclinD1蛋白的表達

表3 食管鱗癌組織中Ki67、CyclinD1蛋白的表達與不同臨床參數之間的關系±s

表3 食管鱗癌組織中Ki67、CyclinD1蛋白的表達與不同臨床參數之間的關系±s

臨床病理特征 Ki67 P值 CyclinD1 P值年齡(歲)446±26 0.000 392±27 0.000≤60(n=35) 457±23 400±30＞60(n=25) 459±36 0.778 403±28 0.682性別男(n=40) 459±25 402±29女(n=20) 455±36 0.659 400±29 0.847分化程度高/中(n=45) 451±26 395±24低(n=15) 479±26 0.001 419±37 0.005浸潤深度纖維膜(n=42) 463±26 409±22未達到纖維膜(n=18) 446±33 0.032 383±35 0.008淋巴結轉移陽性(n=19) 483±14 422±22陰性(n=41)

2.4 食管癌組織中Ki67與CyclinD1蛋白表達的相關性分析流式細胞術結果顯示，食管癌組織中Ki67蛋白表達與CyclinD1蛋白表達呈正相關(Pearson相關系數 =0.275，P=0.034)。

3 討論

食管癌是我國較常見的惡性腫瘤，發病率及病死率高，嚴重威脅著人們的生命健康，闡明食管癌的發生機制對食管癌的早期診斷具有重要的意義。研究發現，細胞周期紊亂能夠導致腫瘤的發生［7，8］，是腫瘤發生的促使因素。Ki67和CyclinD1是調控細胞周期的重要因子。

Ki67是一種核增殖抗原［9］，存在于細胞周期的 G1、S、G2、M期，G1后期開始出現，在S期和G2期逐漸升高，M期達到高峰，但G0期無表達。而且還發現Ki67在S期聚集，尤其是在后半期表達率明顯增高，故Ki67只表達于增殖期細胞，而不表達于靜止期細胞。Ki67表達的高低反映了細胞增殖狀態，是目前應用最廣泛的增殖細胞標記之一。Ki67在細胞中的高表達可以使細胞具有增值旺盛的能力，促使腫瘤的發生，本實驗中，應用流式細胞術方法檢測食管癌組織中Ki67蛋白的表達顯著高于食管正常組織，Ki67的高表達可能參與了食管癌的發生。同時檢測了食管癌組織中Ki67的表達與不同臨床參數之間的關系發現，Ki67表達量在低分化者、浸潤深度達到纖維膜者、有淋巴結轉移者顯著高于中高分化者、浸潤深度未達到纖維膜者、無淋巴結轉移者，提示Ki67可能參與了食管癌惡性度轉化過程，可作為食管癌惡性度及預后判斷的指標。

研究發現，在細胞周期進程中，CyclinD1主要功能是調控細胞周期從G1期進入 S期［10］，促進細胞增殖，當CyclinD1蛋白在細胞中表達異常增高時，將引起細胞增殖周期失調，從而導致腫瘤的發生。本實驗中，檢測到食管癌組織中CyclinD1蛋白的表達顯著高于食管正常組織，CyclinD1的高表達可促使細胞周期從G1期過渡至S期，使細胞呈現旺盛的增值能力，參與了食管癌的發生。同時檢測了食管癌組織中CyclinD1表達水平在低分化者、浸潤深度達到纖維膜者、有淋巴結轉移者顯著高于中高分化者、浸潤深度未達到纖維膜者、無淋巴結轉移者，提示CyclinD1可能參與了食管癌惡性度轉化過程，可作為食管癌惡性度和預后判斷的指標。而且經統計學分析，食管癌組織中Ki67蛋白的表達與CyclinD1蛋白表達具有正相關性。腫瘤發生是多基因、多因素引起的，Ki67、CyclinD1在細胞中的異常表達可能共同參與了食管癌的發生及發展。

綜上所述，提示Ki67與CyclinD1蛋白在食管組織細胞中的異常高表達可能參與了食管癌發生及發展，聯合檢測這兩個指標對食管癌的早期診斷具有一定的臨床意義，而且為食管癌的靶向治療提供新的研究方向。

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Expression and significance of Ki67 and CyclinD1 protein in esophageal squamous cell carcinoma

ZHENG Fazhu，MU Fang，ZHANG Li，et al．Department of Surgery，Handan People’s Hospital，Hebei，Handan 056001，China

ObjectiveTo investigate the expression and significance of Ki67 and CyclinD1 protein in esophageal squamous cell carcinoma，and to explore the correlation between the expressions of Ki67，CyclinD1 protein and pathogenesis as well as progression of esophageal squamous cell carcinoma.MethodsThe levels of Ki67，CyclinD1 protein expression in 60 cases of normal esophageal mucosa and esophageal carcinoma tissues were detected by flow cytometry.The correlation between the expression of Ki67，CyclinD1 protein and clinicopathological characteristics of esophageal squamous cell carcinoma was analyzed.ResultsThe expression levels of Ki67，CyclinD1 protein in esophageal squamous cell carcinoma were significantly higher than those in normal esophageal tissues(P ＜0.05).The expression levels of Ki67，CyclinD1 protein in esophageal cancer were closely correlated with the degrees of differentiation，metastasis of lymph node and the invasive depth of the tumor(P ＜0.05).There was no significant correlation between Ki67，CyclinD1 protein expression in esophageal cancer and the patients'gender，age(P ＞0.05).There was a positive correlation between ki67 protein expression and CyclinD1 protein expression in esophageal cancer.ConclusionThe high-expression of Ki67 and CyclinD1 may be involved in the pathogenesis and advancement of esophageal squamous cell carcinoma，which may induce the high proliferation of cells，then result in the tumorigenesis.The combination detection of Ki67 and cyclinD1 can be used as valuable diagnosis indexes for esophageal carcinoma.

flow cytometry;esophageal squamous cell carcinoma;Ki67;cyclinD1

R 735.1

A

1002-7386(2011)09-1293-03

10．3969/j．issn．1002-7386．2011．09．004

056001 河北省邯鄲市人民醫院外科

沈鴻彬，056001 河北省邯鄲市人民醫院外科;E-mail:laoyindy1010@163.com

2011-02-18)

·論著·