胞質HuR在卵巢上皮性癌的表達及意義

齊玉明 石彬 郭皓 成艷梅

胞質HuR在卵巢上皮性癌的表達及意義

齊玉明 石彬 郭皓 成艷梅

目的檢測HuR在卵巢上皮性癌中的表達及與臨床病理參數的關系，尋求卵巢癌的預后因素。方法 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法和逆轉錄RT-PCR技術，檢測胞質和胞核HuR在正常、交界性、惡性卵巢組織中的表達;分析胞質HuR的表達與預后的關系。結果 胞質和胞核HuR在惡性卵巢腫瘤組織的表達明顯高于交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織，胞質和胞核HuR在交界性卵巢腫瘤的表達與正常卵巢組織比較無顯著性差異;胞質HuR的表達隨組織學分級、臨床分期增高，陽性表達率逐漸增高，胞核HuR的表達與臨床病理參數無關。結論 HuR的過表達可能在卵巢癌的發生發展中起重要作用，檢測胞質HuR在卵巢癌中的表達可預測該腫瘤生物學行為特征，可作為獨立的預后指標。

卵巢上皮性癌;胞質;胚胎致死異常視覺A;預后

HuR是RNA結合蛋白中胚胎致死異常視覺(ELAV)家族的一員，ELAV家族是最緊密的RNA結合蛋白。HuR廣泛存在于幾乎所有的增殖細胞中，通過一定的信號途徑參與細胞的增殖、分化等多種細胞行為的調節。人體內有多種細胞可分泌HuR，但在一些正常組織中表達水平很低，而在許多惡性腫瘤中表達水平增高，且與預后不良有關。本研究旨在檢測HuR在卵巢上皮性癌的表達，并分析胞質HuR表達與臨床病理參數的關系，為臨床治療提供新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2001年6月至2008年8月，在河北醫科大學第二臨床學院婦科因卵巢上皮性癌而接受手術治療的患者68例，平均年齡52歲。術前均未接受放療、化療、激素及免疫治療，術后病理組織學診斷明確。按照WHO(1973)標準將研究對象進行組織學分類及分級，其中包括漿液性囊腺癌44例，黏液性囊腺癌18例，子宮內膜癌6例;病理分級:高分化10例，中分化30例，低分化28例;有淋巴結轉移者30例，無淋巴結轉移者38例;按照2000年FIGO臨床分期標準，其中Ⅰ期11例，Ⅱ期16例，Ⅲ期31例，Ⅳ期10例;選擇同期交界性卵巢腫瘤10例(漿液性6例和黏液性4例)和同期因其他原因行子宮+雙附件切除的正常卵巢5例。

1.2 方法

1.2.1 標本采集:腫瘤切下后，從腫瘤生長活躍、無壞死的邊緣部位取下約1 cm3大小的組織2塊，一塊放入甲醛溶液固定、石蠟包埋，用于免疫組化測定;另一塊裝入酶滅活的凍存管，迅速投入液氮中，然后轉入-80℃冰箱保存待測。

1.2.2 免疫組化法檢測卵巢上皮性癌組織、交界性卵巢腫瘤組織、正常卵巢組織中HuR的表達:標本常規脫水、包埋并制成4 μm厚的連續切片，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法，進行組化檢測。兔抗人多克隆HuR抗體為Santa Cruz產品，兔SP免疫組化試劑盒、DAB試劑盒均購于北京中杉金橋試劑公司。染色步驟按SP試劑盒(北京中杉金橋試劑公司)說明書進行，一抗滴度為1∶200。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照。

1.2.3 RT-PCR技術檢測卵巢上皮性癌和正常卵巢組織中HuR mRNA的表達:引物及試劑盒由北京賽百盛基因有限公司提供。采用 TRIzol一步法提取組織總 RNA。反應總體積20 μl，RNA 模板量1 μg，參照試劑盒說明進行。產物長度及引物序列如下:HuR片段長度為 220 bp，上游引物:5’CGCAGAGATTCAGGTTCTCC-3’，下游:5’CCAAACCCTTTGCACTTGTT-3’;β-actin 片段長度為 540 bp，上游引物:5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游引物:5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。PCR反應條件:94℃預變性3 min、94℃變性 40 s、58℃退火 40 s、72℃延伸 40 s，33 次循環后 72℃延伸5 min。取5μl PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，β-actin作為內參照物，紫外透射成像系統顯像，測定特異條帶的密度并與內參照比較，得出目的基因mRNA的相對表達量。

1.3 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胞核HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢腫瘤和正常卵巢中的表達 胞核HuR在卵巢癌、交界性腫瘤及正常卵巢中的陽性表達率分別為76.47%(52/68)、30.00%和0。卵巢癌中胞核HuR的表達明顯高于交界性卵巢腫瘤和正常卵巢(P＜0.05)。見表 1，圖1。

表1 HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織胞核中的表達 例(%)

圖1 胞核HuR在子宮內膜樣卵巢癌的陽性表達(SP×400)

2.2 胞質HuR在卵巢癌、交界性腫瘤和正常卵巢中的表達胞質HuR在卵巢癌、交界性腫瘤及正常卵巢中的陽性表達率分別為45.60%(31/68)、10.00%和0。卵巢癌中胞質HuR的表達明顯高于交界性卵巢腫瘤和正常卵巢(P＜0.05)。見表2，圖 2。)

表2 胞質HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中的表達 例(%)

圖2 胞質HuR在漿液性卵巢癌的陽性表達(SP×400

2.3 正常卵巢與卵巢上皮性癌組織HuRmRNA的表達 68例卵巢癌中54例為陽性表達(79.41%)，5例正常卵巢中1例為陽性表達(20.00%)，卵巢上皮性癌和正常卵巢組織中HuR mRNA表達水平分別為0.381±0.034和0.114，差異有統計學意義(P ＜0.01)。見表3，圖3。

表3 正常卵巢與卵巢上皮性癌組織HuRmRNA的表達±s

表3 正常卵巢與卵巢上皮性癌組織HuRmRNA的表達±s

類別 HuRmRNA光密度值 P值正常卵巢組織(n=5)0.112±0.011 ＜0.01卵巢癌(n=68)0.381±0.034

圖3 正常卵巢與卵巢上性癌組織HuRmRNA的表達

2.4 胞質HuR的表達與卵巢上皮性癌臨床病理學特征的關系 胞質HuR與卵巢癌臨床分期和組織學分級有相關性，而與發病年齡、組織學類型和淋巴結轉移無相關性。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期胞質HuR的陽性表達率(56.09%)顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(29.63%)，差異有統計學意義(P＜0.05)。在組織學分級1級(高分化)、2級(中分化)、3級(低分化)胞質HuR的陽性表達率分別為10.00%、46.67%、57.14%，差異有統計學意義(P＜0.05)，胞質HuR的表達在中、低分化之間差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表4。

表4 胞質HuR的表達與卵巢上皮性癌臨床病理學特征的關系

3 討論

3.1 HuR在卵巢上皮性癌中表達的意義 HuR是ELAV家庭的一員，又稱為類胚胎致死異常視覺蛋白A。ELAV家庭是最緊密的RNA結合蛋白，最初是在果蠅中被發現。ELAV家庭共包括四個成員:HuD、HuC、Hel-N1(HuB)和 HuR。HuR幾乎在所有增殖的細胞中表達，而其他三個成員主要表達在終端分化的神經組織中。1996年，Ma等［1］利用PCR技術首先識別并克隆了HuR基因。許多早期反應基因的mRNAs在其3'非翻譯區(untranslated regins，UTR)有 AU富含元件(AU-rich elements，AREs)，可以與順式反應元件一起調節mRNAs的不穩定性。HuR分子量為36 kD，HuR即可與AREs相互作用，并且在轉染哺乳動物細胞后穩定包含AREs的mRNAs并使之過表達，導致HuR表達增強。在人類許多惡性腫瘤，如乳腺癌［2］、結腸癌［3］、胃癌［4］、肺癌等中HuR的陽性表達率明顯增高，表明HuR在惡性腫瘤的發生、發展中有一定作用［5］。本實驗顯示，HuR在卵巢上皮性癌中的表達明顯高于交界性腫瘤和正常卵巢。為進一步證實HuR在惡性腫瘤中的表達，本實驗又從mRNA水平檢測HuR的表達率。結果顯示:HuRmRNA在卵巢癌的表達率顯著高于正常卵巢。表明，HuR的異常表達與卵巢癌的發生、發展有密切關系。HuR作為一種RNA結合蛋白，一方面可與許多基因的mRNA結合，從而調節細胞生長、分化、血管發生、蛋白表達調控等，導致腫瘤的發生。另一方面，HuR還可與許多基因相結合，如環氧合酶 2［6］、血管內皮生長因子(VEGF)［7］、炎性因子 IL-8、6 和腫瘤壞死因子(TNF)［8］、細胞周期調節蛋白 cyclinA和 cyclinB1、蛋白激酶 C的底物MARCKS，原癌基因 c-fos，uPA 和 uPA 受體等［9］，這類基因與惡性腫瘤的發生、發展和浸潤密切相關。推測，HuR的表達上調可能是這些基因表達上調的原因之一，從而引起惡性腫瘤的發生。

3.2 HuR在胞質和胞核的表達及與臨床指標的關系 近來研究表明HuR可以在核質間穿梭［10］，HuR即可在胞核表達，也可在胞質表達。Hu蛋白含有3個保守的RNA識別模序(RNA recognition motifs，RRMs)，在RRM2和RRM3之間有鉸鏈區，該區內含一段包含52個氨基酸的HuR核質穿梭(HuR nucleocytoplasmic shuttling，HNS)區，對細胞定位和功能相當重要。可先與包含ARE的mRNAs在細胞核內結合，然后與之一起進入細胞質，保護mRNAs避免其衰變降解，從而導致HuR在多種惡性腫瘤中表達上調。Gallouzi等［11］研究表明HuR可以通過2種不同途徑進入細胞質。一種是需要4種蛋白配體的依賴染色體區域維持蛋白質(CRM1)，另一種是非依賴CRM1而需要HNS，正是通過上述兩種機制，使HuR在核與質間穿梭，從而使HuR在胞核與胞質均有表達。但是，許多結果顯示胞質HuR的表達與臨床病理參數和預后有關，而胞核HuR的表達與臨床病理參數和預后無關［12］。本研究選擇了與卵巢癌關系最密切的五個臨床參數，結果顯示，胞質HuR在卵巢癌中的表達，隨著組織學分級的增加與分期的增加，表達率明顯增加。未發現胞核HuR的表達與臨床病理參數存在相關性。提示惡性程度越高，臨床分期越晚，卵巢癌組織中胞質HuR的表達越強，患者的預后越差。胞質HuR的表達可能是影響癌癥患者預后的因素之一［13］。但是對于其胞質分布的機理，有待進一步的研究。

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8 Ulus Atasoy，Stephanie L，Curry Isabel，et al.Regulation of Eotaxin Gene expression by TNF-α and IL-4 through mRNA stabilization:involvement of the RNA-binding protein HuR.J Immunol，2003，171:4369-4378.

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12 Heinonen M，Bono P，Narko K，et al.Cytoplasmic HuR expression is a prognostic factor in invasive ductal breast carcinoma.Cancer Res，2005，65:2157-2161.

13 Brosens LA，Keller JJ，Pohjola L，et al.Increased expression of cytoplasmic HuR in familial adenomatous polyposis.Cancer Biol Ther，2008，7:424-427.

The expression and significance of cytoplasmic HuR in epithelial ovarian carcinoma

QI Yuming*，SHI Bin，GUO Hao，et al．The Second Department of Gynecology，Handan Central Hospital，Hebei，Handan 056000，China

ObjectiveTo investigate the correlation between the expression of HuR in epithelial ovarian cancer and clinicopathological parameters in order to explore the factors that affect the prognosis of patients with epithelial ovarian carcinoma.MethodsThe expressions of cytoplasmic and nuclear HuR in normal ovary tissues，borderline tissue of ovary tumor and epithelial ovarian carcinoma were detected by SP immunohistochemical technique and RT-PCR.The relationship between cytoplasmic HuR expression and prognostic factors was analyzed.ResultsThe expressions of cytoplasmic and nuclear HuR in epithelial ovarian cancer tissue were significantly higher than those in borderline tissue of epithelial ovarian tumor and normal ovarian tissues，however，there was no significant difference between the borderline tissue of epithelial ovarian tumor and normal ovarian tissue(P＞0.05).The statistical analysis showed that the positive expression rate of cytoplasmic HuR in epithelial ovarian carcinoma was closely correlated with histological grade and FIGO stage，but the positive expression rate of nuclear HuR was not correlated with the clinicopathological parameters.ConclusionThe over-expression of HuR may play an important role in the growth and progress of epithelial ovarian carcinoma.To detect the expression of cytoplasmic HuR in epithelial ovarian carcinoma may predict the characteristics of oncobiology behaviour.The expression of cytoplasmic HuR may act as an independent prognostic indicator.

epithelial ovarian carcinoma;cytoplasmic;HuR;prognosis

R 737.31

A

1002-7386(2011)09-1296-04

10．3969/j．issn．1002-7386．2011．09．005

056000 河北省邯鄲市中心醫院婦二科(齊玉明);河北醫科大學第二醫院婦科(石彬);河北省邯鄲市中心醫院ICU(郭皓)，婦二科(成艷梅)

石彬，050051 河北醫科大學第二醫院婦科;E-mail:cysboy@sina.com

2010-10-11)

·論著·