吉西他濱和絲裂霉素聯合應用對人肺癌細胞A549的作用

趙可新 李軍霞 姜杉 王偉剛 胡建平 單靖珊

吉西他濱和絲裂霉素聯合應用對人肺癌細胞A549的作用

趙可新 李軍霞 姜杉 王偉剛 胡建平 單靖珊

目的觀察吉西他濱和絲裂霉素聯合應用對人肺癌細胞A549的抑制效應，并探討其作用機制。方法 用MTT法檢測化療藥物對人肺癌細胞A549生長的抑制作用;流式細胞術(FCM)檢測細胞周期分布和凋亡率。結果 (1)絲裂霉素和吉西他濱單獨和聯合用藥可濃度依賴性抑制A549細胞的生長。(2)絲裂霉素和吉西他濱在合用72 h后，當Fa＞0.18時，絲裂霉素和吉西他濱合用指數CI均＜1，兩種藥物之間是協同作用，當Fa＜0.18時，合用指數CI大于1，兩種藥物之間為拮抗作用。(3)絲裂霉素和吉西他濱同時用藥時抑制率最高，其次是先用絲裂霉素后用吉西他濱，抑制率最低是先用吉西他濱后用絲裂霉素。(4)絲裂霉素和不同濃度的吉西他濱合用，除與2.5 μg/ml吉西他濱合用時CI＞1外，其余均＜1。10 μg/ml吉西他濱和不同濃度的絲裂霉素合用，除與0.0625 μg/ml合用時CI＞1外，其余均＜1。(5)絲裂霉素和吉西他濱單用和合用時對細胞周期和凋亡均有影響。結論 絲裂霉素和吉西他濱單獨和聯合用藥可濃度依賴性抑制A549細胞的生長。不同用藥次序和藥物濃度比例也影響藥物聯合作用。

吉西他濱;絲裂霉素;人肺癌A549;中效原理

腫瘤是一群失去正常生長調控機制，發生惡性轉化的自身細胞，其在人群中發病率高，全世界每年死于惡性腫瘤的患者高達數百萬人［1］，人們提出了多種治療方法包括手術治療、放療、化療、免疫治療等，其中化學治療仍是主要的治療方式，但是化學治療也受到選擇性低、不良反應大、耐藥性等因素的限制，為了避免上述的缺點，采用合理的聯合用藥方式對腫瘤的治療更具潛力。然而采用哪些藥物，劑量怎么搭配等以往多憑經驗。由于抗腫瘤藥物的療效差異很大，不同組織類型腫瘤對同一種藥物反應不一致。因此在化療前進行抗癌藥物敏感性測試，用中效原理定量分析各抗癌藥物之間的協同、相加、拮抗作用，將為臨床正確部署抗癌藥物聯合化療方案提供有價值的參考［2］。凋亡受阻是腫瘤發生的主要原因，誘導腫瘤細胞分化和凋亡是許多化療藥物抑制腫瘤細胞生長的主要機制之一，另外，對于細胞周期的干擾也是許多化療藥物主要的作用機制［3，4］。本實驗中，我們利用中效原理研究了絲裂霉素和吉西他濱聯合用藥方式對培養的人肺癌細胞系A549的作用以及對細胞周期和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 酶標儀(德國BMG公司);恒溫CO2培養箱(Kendro公司);電子天平(日本Olympus公司);倒置顯微鏡(江蘇富華儀器廠);恒溫水浴箱(Thermo Forma公司);超低溫冰箱(VILBER LOURMAT公司);VD-1320型潔凈工作臺(哈爾濱市東聯電子技術發展有限公司);Millipore純水機(美國Millipore公司)。

1.2 藥品 RPMI-1640培養基(Gibco公司);胰酶(Gibco公司);青霉素(華北制藥集團公司);鏈霉素(華北制藥集團公司);胎牛血清(Gibco公司);DMSO(Sigma公司);胎盤藍(哈爾濱譽衡藥業有限公司);吉西他濱(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司);絲裂霉素(浙江海正藥業股份有限公司)。

1.3 實驗用細胞系 人肺癌A549細胞株由河北醫科大學病

理教研室惠贈，河北醫科大學藥理教研室傳代培養。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養:人肺癌A549細胞置于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素，pH值為7.2～7.4的RPMI-1640培養液中，于37℃，5%CO2和飽和濕度的培養箱中常規培養。1～2 d傳代1次。

1.4.2 細胞毒的測定:取對數生長期的A549細胞制備細胞懸液，計數后用1640培養基調細胞濃度為1×105個/ml。按100 μl/孔接種于96孔板，待細胞貼壁6 h后，輕輕吸去上清，分別加入所需濃度藥物200 μl，同時設不含藥物的陰性對照孔。每濃度設6孔，繼續培養72 h，在取樣前4 h加入MTT(濃度為 5 g/L，用0.1mol/LPBS 配制)20 μl，繼續培養4 h，輕輕棄去上清，每孔加入150 μl DMSO，微量振蕩器振蕩10 min，結晶物充分溶解后，酶標儀上測每孔的570 nm的OD值(OD570)。通過下列公式計算細胞生長抑制率(Fa):生長抑制率=(實驗組OD570值-對照組OD570值)/對照組OD570值。

吉西他濱藥物濃度為 2.5，5.0，10.0，20.0，40.0 μg/ml;絲裂霉素藥物濃度為 0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 μg/ml;吉西他濱+絲裂霉素聯合用藥組藥物濃度為逐一聯合應用，分別為2.5+0.0625、5.0+0.125、10.0+0.25、20.0+0.5、40.0+1.0 μg/ml。

研究不同藥物濃度依賴關系時，采用絲裂霉素0.25 μg/ml和不上述同濃度的吉西他濱合用，采用10 μg/ml吉西他濱和上述不同濃度的絲裂霉素合用。

1.4.3 中效劑量(Dm)及合用指數(CI)的計算:2個參數的計算參考文獻［5］。

1.4.4 流式細胞術檢測細胞周期分布和凋亡率:收集絲裂霉素組、吉西他濱組和聯合用藥組培養72 h后A549細胞，胰酶消化后，離心去上清，加PBS將細胞打勻，轉入EP管中，再次離心去上清，加入預冷70%乙醇固定1 h，PBS洗2次，將等體積的細胞懸液和PI染液混合，4℃放置30min，混合液過300目尼龍網除去雜質，上機檢測。

2 結果

2.1 絲裂霉素和吉西他濱單獨和聯合用藥可依據濃度依賴性抑制A549細胞生長情況 絲裂霉素在0.0625～1 μg/ml藥物濃度范圍內，用藥后72 h時抑制率增加到10.8% ～46.7%，IC50是1.07 μg/ml(表 1、2和圖 1)。吉西他濱在 2.5～40 μg/ml藥物濃度范圍內，用藥后72 h，抑制率增加到7.4% ～47.5%。IC50是49.62 μg/ml(表1、2和 圖2)。聯合應用絲裂霉素和吉西他濱后，在2.5625～41 μg/ml藥物濃度范圍內，用藥后72 h時抑制率增加到 15.0% ～81.1%。IC50為9.68 μg/ml，其 中 含 絲 裂 霉 素 0.23 μg/ml 和 吉 西 他 濱9.45 μg/ml。見表 1、2 和圖 3。

表1 絲裂霉素和吉西他濱單獨和聯合用藥72 h后對人肺癌A549細胞的作用n=6，±s

表1 絲裂霉素和吉西他濱單獨和聯合用藥72 h后對人肺癌A549細胞的作用n=6，±s

注:抑制率1:同時用藥的抑制率;抑制率2:先用絲裂霉素后用吉西他濱;抑制率3:先用吉西他濱后用絲裂霉素時的抑制率

絲裂霉素 +絲裂霉素劑量(μg/ml)抑制率(%)吉西他濱劑量(μg/ml)抑制率(%)吉西他濱劑量(μg/ml)抑制率1(%)抑制率2(%)抑制率3(%)0.0625 10.8 2.5 7.4 2.5625 15.0 10.9 9.8 0.125 23.9 5 20.4 5.125 39.9 29.8 23.5 0.25 28.7 10 26.1 10.25 52.9 37.8 51.5 0.5 37.4 20 30.2 20.5 70.8 59.2 64.2 1 46.7 40 47.5 41 81.1 77.1 70.8

表2 絲裂霉素和吉西他濱單獨和聯合用藥的相關系數(r)、斜率(b)、截距(a)和半數有效濃度(IC50)

圖1 吉西他濱對A549腫瘤細胞生長的抑制作用

聯合用藥72 h后，絲裂霉素的IC50從單用的1.07 μg/ml降低到合用的0.23 μg/ml，降低了78.5%。吉西他濱的IC50從單用的49.62 μg/ml降低到9.45 μg/ml，降低了 81.0%。無論是絲裂霉素還是吉西他濱在合用后IC50均明顯降低。

2.2 絲裂霉素和吉西他濱聯合用藥時的合用指數CI 在合用72 h后，當Fa＞0.18時，絲裂霉素和吉西他濱合用指數CI均小于1，兩種藥物之間是協同作用，當Fa＜0.18時，合用指數CI大于1，兩種藥物之間為拮抗。見表3、圖4。

圖2 吉西他濱和絲裂霉素聯合用藥時在不同抑制率下的合用指數

圖3 絲裂霉素和吉西他濱聯合用藥對人肺癌A549細胞的作用

表3 絲裂霉素和吉西他濱聯合用藥時在不同抑制率下的合用指數

2.3 絲裂霉素和吉西他濱用藥時間先后次序依賴關系 絲裂霉素和吉西他濱同時用藥時抑制率最高，其次是先用絲裂霉素，抑制率最低是先用吉西他濱。見表1、圖3。

2.4 絲裂霉素和吉西他濱合用時不同藥物濃度依賴關系 絲裂霉素 0.25 μg/ml和不同濃度的吉西他濱合用，除與2.5 μg/ml合用時 CI＞1 外，其余均 ＜ 1.10 μg/ml，吉西他濱和不同濃度的絲裂霉素合用，除與0.0625 μg/ml合用時CI＞1外，其余均＜1。見表4。

2.5 絲裂霉素和吉西他濱單用或合用時對細胞周期和凋亡的作用 對照組細胞周期各比例分別為:G2/M期22.0%，G0/G1期59.6%，S期6.2%。應用0.25 μg/ml絲裂霉素后，G0/G1期和S期降低到21.5%和17.5%，G2/M期細胞比例升高到69.6%，凋亡率增加到15.9%。應用10 μg/ml吉西他濱后，G0/G1和G2/M期降低到53.8%和19.1%，S期細胞比例升高到27.2%，凋亡率升高24.7%。聯合用藥后，G0/G1和G2/M期細胞比例降低到53.6%和12.9%，S期細胞比例升高到33.3%，凋亡率升高44.7%。見表5、圖5。

3 討論

圖4 絲裂霉素對A549腫瘤細胞生長的抑制作用

表4 絲裂霉素和吉西他濱不同劑量聯合用藥時的抑制率和合用指數

表5 絲裂霉素和吉西他濱單獨或聯合用藥對A549細胞凋亡率和細胞周期分布的作用n=5，±s

表5 絲裂霉素和吉西他濱單獨或聯合用藥對A549細胞凋亡率和細胞周期分布的作用n=5，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05，*P ＜0.01

細胞周期分布(%)組別 劑量(μg/ml))G0/G1期 G2/M期 S期 凋亡率(%)對照0 56.5±3.7 22.0±1.2 21.5±2.6 6.2±1.9絲裂霉素 0.25 12.9±2.1# 69.6±1.3# 17.5±1.9* 15.9±1.3#吉西他濱 10 53.8±2.9 19.1±2.8 27.2±3.6+ 24.7±4.2#絲裂霉素+吉西他濱 0.25+10 53.6±3.5 12.9±1.2# 33.5±3.6# 44.7±0.6#

圖5 絲裂霉素和吉西他濱單獨或聯合用藥對A549細胞凋亡率和細胞周期分布的作用

由于肺癌沒有有效的普查方法，患者在確診時已屬中晚期，手術治療的可能性極低，因此，化療成為延長肺癌患者生命的重要方法之一，而肺癌單藥化療療效較差，且不良反應明顯，合理的聯合用藥可減輕藥物毒性而療效不減［6］。在本實驗中，我們研究了絲裂霉素和吉西他濱聯合用藥對人肺癌A549細胞的作用，絲裂霉素是一種烷化劑抗癌藥，它的兩個烷化中心可與DNA形成交叉連接，使細胞中DNA解聚，抑制DNA復制，還可引起DNA單鏈斷裂［7］。我們也用流式細胞術檢測了絲裂霉素對細胞周期和凋亡率的影響，流式細胞術是一種檢測細胞周期和凋亡的確實可靠的實驗方法［8］，結果表明，絲裂霉素可濃度依賴性抑制腫瘤細胞的生長，與其使A549細胞停滯于G2/M期，誘發細胞凋亡有關。

吉西他濱是一種新型的脫氧胞苷類似物和核苷還原酶抑制劑，對多種實體瘤具有良好的抗腫瘤活性，是一種藥物前體，被細胞攝入后，在細胞內轉變為活性代謝物吉西他濱二磷酸酯或三磷酸酯，可競爭性抑制DNA鏈的延長，導致DNA片段形成和細胞死亡，發揮細胞毒作用［9，10］。我們的研究結果顯示，吉西他濱可濃度依賴性抑制腫瘤細胞的生長，其機制與吉西他濱誘發細胞凋亡有關。

聯合應用絲裂霉素和吉西他濱后，對A549細胞的抑制率明顯高于單獨用藥時，絲裂霉素和吉西他濱的IC50與單獨用藥相比也均明顯降低。通過對CI的分析也表明，當Fa＞0.2時，絲裂霉素和吉西他濱之間呈現協同作用，＜0.2時，呈現拮抗作用。這種化療藥物小劑量聯合呈現拮抗，大劑量出現協同的現象也曾有報道［11］。聯合應用絲裂霉素和吉西他濱后，A549細胞明顯阻滯于S期，而且凋亡率明顯增加。

絲裂霉素和吉西他濱給藥次序不同也影響結果，研究結果表明，兩種藥物同時用藥時，對腫瘤細胞A549的抑制率最高，其次是先用絲裂霉素，這可能與先用細胞非周期性藥物殺死處于非增殖期的細胞(G0)，然后用細胞周期特異性藥物增強療效有關［12］。

順鉑的作用似烷化劑，主要作用靶點為DNA，干擾DNA的復制，屬于細胞周期時相非特異藥物，只要細胞處于活化的細胞周期，藥物就能起作用。隨著藥物作用時間的延長，活化期的細胞可被逐漸殺滅，而且處于靜止期(G0)的細胞活化后進入細胞周期也可被藥物殺滅［13］。我們的研究結果顯示，順鉑可濃度依賴性抑制腫瘤細胞的生長，其機制與其阻滯細胞于G2/M期和誘發細胞凋亡有關。

吡柔比星是半合成的蒽環類抗癌藥，進入細胞核內迅速嵌入DNA核酸堿基對間，干擾轉錄過程，阻止mRNA合成，抑制DNA聚合酶以及DNA拓撲異構酶Ⅱ活性，干擾DNA合成［14］。我們的研究結果顯示，吡柔比星可濃度依賴性抑制腫瘤細胞的生長，其機制與其阻滯細胞于S期和誘導細胞凋亡有關。

聯合應用吡柔比星和順鉑后，對A549細胞的抑制率明顯高于單獨用藥時，吡柔比星和順鉑的IC50均比單獨用藥時均明顯降低。通過對CI的分析也表明，吡柔比星和順鉑之間呈現協同關系。聯合應用吡柔比星和順鉑后，可阻滯細胞于S期，細胞凋亡率也明顯增加。

吡柔比星和順鉑給藥次序不同也影響結果，兩種藥物同時用藥時，對腫瘤細胞A549的抑制率最高，不同吡柔比星和順鉑濃度比例對細胞的抑制率也有明顯的影響。

從本實驗中，我們可以看到，小劑量聯合應用化學藥物可明顯提高療效;但是，兩藥合用并非藥物濃度越大越好，適宜的濃度比例關系也是聯合用藥時需要考慮的因素。

絲裂霉素和吉西他濱單獨或聯合用藥可濃度依賴性抑制A549細胞的生長。在合用72 h后，當Fa＞0.18時，兩種藥物之間是協同作用，當Fa＜0.18時，兩種藥物之間為拮抗。合用時不同用藥次序和藥物濃度比例也影響藥物聯合作用。所有藥物的作用均與其誘導凋亡和影響細胞周期有關，但對細胞周期的影響各不相同。

1 鄭東慶，薄挽瀾，梁桃.三氧化二砷對人肺癌A549細胞凋亡及耐藥基因表達的影響.中國基層醫藥，2010，17:7-8.

2 Nair SK，Verma A，Thomas TJ，et al.Synergistic apoptosis of MCF-7 breast cancer cells by 2-methoxyestradiol and bis(ethyl)norspermine.Cancer Lett，2007，250:311-322.

3 Hannun AH.Apoptosis and the dilemma of cancer chemotherapy.Blood，1997，89:1845-1853.

4 Glinsky GV，Glinsky VV，Ivanova AB，et al.Apoptosis and metastasis:increased apoptosis resistance of metastatic cancer cells is associated with the profound deficiency of apoptosis execution mechanisms.Cancer Lett，1997，115:185-193.

5 趙可新，李軍霞，姜杉，等.吉西他濱和依托泊苷聯合應用對人卵巢癌3AO細胞系的作用.中國醫院用藥評價與分析，2008，8:526-530.

6 Mortenson MM，Schlieman MG，Virudachalam S，et al.Effect of the proteasome inhibitor bortezomib alone and in combination with chemotherapy in the A549 non-small-cell lung cancercell line.Cancer Chemother Pharmacol，2004，54:343-353.

7 Aphinives P，Bhudhisawasdi V，Saeseow O，et al.5-fluorouracil and mitomycin-C:effective，low-cost chemotherapy for colorectal cancer.J Med Assoc Thai，2006，89:1885-1889.

8 Vermes I，Haanen C，Reutelingsperger C，et al.Flow cytometry of apoptotic cell death.J Immunol Methods，2000，243:167-190.

9 Giovannetti E，Mey V，Danesi R，et al.Interaction between gemcitabine and topotecan in human non-small-cell lung cancer cells:effects on cell survival，cell cycle and pharmacogenetic profile.Br J Cancer，2005，92:681-689.

10 Kroep JR，Loves WJ，Vander Wilt CL，et al.Pretreatment deoxycytidine kinase levels predict in vivo gemcitabine sensitivity.Mol Cancer Ther，2002，1:371-376.

11 龔軍，王正文，朱明才，等.金雀異黃素和5-Fu對人結腸癌細胞株(SW480)的相互作用的體外觀察.中國現代醫學雜志，2006，16:873-876.

12 段紅，張俊文，湯為學，等.5-氟尿嘧啶及絲裂霉素對人胃癌細胞株SGC-7901及BGC-823的相互作用的體外觀察.中國病理生理雜志，2002，18:259-261.

13 Charoentum C，Thongprasert S，Chewaskulyong B，et al.Experience with gemcitabine and cisplatin in the therapy of inoperable and metastatic cholangiocarcinoma.World J Gastroenterol，2007，13:2852-2854.

14 Tanaka T，Umesaki N.Radiation reduces pirarubicin sensitivity in human cervical squamous cell carcinoma cells.Oncol Rep，2005，13:1165-1168.

The combination effect of gemcitabine with mitomycin on human lung cancer A549 cell line in vitro

ZHAO Kexin，LI Junxia，JIANG Shan，et al．Central Hospital of China Petroleum Natural Gas Group CO．，LTD，Hebei，Langfang065000，China

ObjectiveTo investigate the combination effect of gemcitabine with mitomycin on human lung cancer A549 cell line in vitro，and to explore its action mechanism.MethodsMTT assay was used to analyze the inhibition effect of chemotherapy drugs on the growth of human lung cancer A549 cell line，and the cell cycle and cell apoptosis were detected by flow cytometry.ResultsThe gemcitabine and mitomycin alone or combination application could inhibit the growth of human lung cancer A549 cell line in a time and concentration dependent mode.The combination index(CI)was less than 1 at 72h when Fa＞0.18，which indicated that gemcitabine and mitomycin had synergistic effect.However，the combination index was more than 1 at 72h when Fa ＜ 0.18，which indicated that gemcitabine and mitomycin had antagonistic effect.The combination application of gemcitabine with mitomycin could get the highest inhibitory rate，next，the moderate inhibitory rate was got when mitomycin was given prior to gemcitabine，and the lowest inhibitory rate was got when gemcitabine was given prior to mitocymin.The CI was all less than 1 when mitomycin was combined with gemcitabine at different concentrations.The gemcitabine and mitomycin alone or combination application had influence on the cell cycle and cell apoptosis.ConclusionThe gemcitabine and mitocymin alone or in combination application can inhibit the growth of human lung cancer A549 cell line in a time-and concentration-dependent manner.The different drug concentrations and medication succession may affect the synergistic effect of the drugs.

gemcitabine;mitomycin;human lung cancer A549 cell line;lente principle

R 730.5;R 734.2

A

1002-7386(2011)09-1301-04

10．3969/j．issn．1002-7386．2011．09．007

065000 河北省廊坊市，中國石油天然氣集團公司中心醫院(趙可新、姜杉、王偉剛、胡建平、單靖珊);河北醫科大學藥理學教研室(李軍霞)

李軍霞，050017 河北醫科大學藥理學教研室;E-mail:lyjunxia@yahoo.com.cn

2011-01-14)

·論著·