TTF-2和TGFβ3在C57BL/6J小鼠腭突發育過程中的表達變化

黃磊 石冰 宋慶高 王龑 鄭謙

哺乳動物繼發腭的發育是一個復雜過程，涉及到將口鼻腔正確分離的幾個過程的協調一致，從腭突產生(胚胎12 d)、上抬(胚胎13 d)到兩側腭突相對運動接觸直至融合(胚胎14 d)，最后覆蓋在口腔側和鼻腔側的黏膜分別分化為復層鱗狀上皮和假復層纖毛狀上皮，這些過程中任何一個環節發生改變都可引起腭裂。目前發現titf2和重組人轉化生長因子β3(TGFβ3)基因突變與這種先天畸形密切相關。Titf2-/-小鼠［1］和人類甲狀腺轉素因子-2(TTF-2)［2，3］基因純合缺陷表現為腭裂及甲狀腺發育不全等畸形，TGFβ3-/-小鼠和人TGFβ3突變也可引起腭裂。在小鼠發育過程中，TTF-2有促進甲狀腺前體細胞遷徙，抑制甲狀腺前體細胞在遷徙過程中分化功能［4］，但對腭中嵴上皮細胞遷徙是否有影響，尚不清楚。TGFβ3主要在腭中嵴上皮細胞表達，在腭突黏附時起關鍵作用。本研究旨在觀察在繼發腭發育過程中，TTF-2和TGFβ3相互作用變化規律。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 (1)成年C57BL/6J小鼠購自四川大學華西醫學中心動物中心，雌鼠4～6周，體重12.0～14.5 g，雄鼠＞6周齡，體重＞20 g，保持12 h晝夜周期制，室溫控制在20～25℃，充足食物，自由飲水(pH值為5)。(2)按雌雄比例2∶1于頭晚20∶00至次日晨8∶00合籠，并于次日晨檢查雌鼠，有陰道栓者為交配陽性，定此日為妊娠零天，記為受孕天數GD0。(3)于妊娠12、13、14 d分別斷頸處死各6只鼠，無菌條件取出胚胎，用眼科剪解離腭突。

1.2 主要試劑 TTF-2羊抗小鼠多克隆IgG購自Santa Cruz，Actin(I-1q)羊抗小鼠多克隆IgG購自Santa Cruz，產品編號SC-1616，Protein DetecterTMWestern Blot Kit BCIP/NBTSystem 購自KPL公司(產品號55-11-50)，SABC-AP免疫組化試劑盒購自博士得公司，產品編號:SA105，APES購自中山公司產品編號ZII-9001、組織細胞蛋白裂解液RIPA購自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.3 組織蛋白提取 (1)每100毫克腭突組織加入1 ml RIPA和10μl PMSF，在冰水浴中電動勻漿。勻漿后冰水浴放置30 min。(2)將樣品轉移到1.5 ml離心管，4℃ 20 000 g離心30 min，將上清液轉移到無菌離心管中備用。

1.4 Western印記檢測TTF-2 取上清液10μl經SDS-PAGE電泳后轉移至硝酸素纖維膜上，1%酪蛋白封閉1 h后，加入1∶500稀釋的羊抗鼠TTF-2多克隆抗體IgG于4℃孵育過夜，于4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗膜后，1∶2 000稀釋的AP一兔抗羊IgG于37℃孵育30min，PBS洗膜后，BCIP/NBT顯色。

1.5 免疫組織化學檢測TTF-2和TGFβ (1)切片制備:將12、13、14 d胎鼠，從口角剪開，顯露腭突，給胚胎頭部矢狀平面連續切取6μm厚切片數張，切片貼于經2%APES防脫片劑打底的載玻片上，經丙酮固定后-20℃貯存備用。(2)冰凍切片免疫組織化學染色步驟:滴加正常兔或山羊血清封閉液，室溫20 min，滴加抗TTF-2IgG(1∶100 稀釋)或抗TGFβ3 IgG(1∶50 稀釋)一抗，4℃過夜，滴加生物素化二抗，室溫20 min，滴加SABC-AP，室溫20 min，BCIP/NBT顯色，核固紅輕度復染，干燥后水溶性封片劑封片。

2 結果

2.1 C57BL/6J 12、13、14 d胎鼠腭突TTF-2表達Western印記結果。見圖1、表1。

圖1 TTF-2表達Western印記

表1 TTF-2表達Western blotting灰度掃描測量結果n=6，±s

表1 TTF-2表達Western blotting灰度掃描測量結果n=6，±s

.00 12 d 13 d 14 d 15 d TTF-2/β-actin 6 310±1 506 7 649±2 379 6 279±1 473 0.00±0

2.2 妊娠12、13、14、15 d胎鼠腭突TTF-2表達變化，從折線圖可見隨著腭突的發育，TTF-2表達變化趨勢:TTF-2在胎胚13 d時表達最多，在胚胎14 d時表達明顯比13 d時減少，胚胎15 d時已不能檢測到TTF-2表達。見圖2。

圖2 TTF-2變化趨勢

2.3 TTF-2、TGFβ3在C57BL/6J 14 d胎鼠腭突冰凍切片免疫組化染色。TTF-2和TGFβ3主要位于腭突中嵴上皮細胞核及核膜上，其免疫組化染色陽性部位在胞核及核膜。在12 d胚胎中，腭突從上頜突伸出呈垂直位，在腭突的上皮細胞中有TTF-2免疫組化染色陽性細胞，在間充質中則為零星分布，此時未見TGFβ3染色陽性細胞。胚胎13 d時，腭突在舌體上方呈水平位，TTF-2在腭突表面上皮細胞中，染色強度較12 d時明顯增強，此時在腭突上皮細胞中亦可見TGFβ3染色陽性細胞。14 d時，兩側腭突已接觸，腭突表面為單層上皮細胞，可見TTF-2染色陽性細胞，但染色強度明顯較12 d時低，此時可見TGFβ3染色最明顯。見圖3、4。

圖3 胚胎14 d TTF-2在腭突表達(免疫組化×200)

圖4 胚胎14 d TGFβ3在腭突表達情況(免疫組化×200)

3 討論

3.1 腭突融合機制 腭突發育過程中，在腭突垂直生長期(12 d)腭中嵴上皮細胞為兩層，腭突上抬呈水平方向生長后(13 d)中嵴上皮細胞由兩層變一層。這有助于腭突發生接觸(14 d)時兩側腭突上皮細胞快速相互插入至間充質細胞而融合。遺傳和(或)環境因素干擾，可對人和動物胚胎組織腭突中嵴上皮細胞的轉歸造成不利的影響。黃磊等［4］研究了地塞米松(DEX)對體外培養的小鼠腭突融合過程的影響，發現DEX促進了腭中嵴上皮分化成復層鱗狀上皮，引起腭突融合障礙，提示腭中嵴上皮的正常轉歸對腭突的融合有決定性作用。

3.2 小鼠腭突發育過程中TTF-2表達的時空性 TTF-2是甲狀腺轉錄因子，為磷酸化蛋白，分子量42 kDa，編碼基因Titf2［5］。titf2-/-小鼠［1］和人類 TTF-2［2，3］純合突變均會引起甲狀腺發育缺陷和腭裂。小鼠發育過程中TTF-2表達有時空性及雙相性，可抑制甲狀腺遷徙過程中特殊上皮細胞--甲狀腺濾泡細胞分化成熟［5］。為了更好地理解TTF-2在腭突形成中的作用，我們使用羊抗小鼠TTF-2多克隆抗體IgG，采用免疫組織化學和western blot方法，原位和半定量詳盡研究了小鼠胚胎發育的12、13、14 d，TTF-2在小鼠腭突中表達變化情況。在C57BL/6J小鼠胚胎的腭突形成(12 d)，上抬(13 d)和融合(14 d)的發育過程中，TTF-2的表達以13 d為最高，免疫組織化學和Western blot結果一致，均證實了這一點，說明腭突中嵴上皮細胞的分化抑制在13 d時達高峰，隨著腭突的發育TTF-2表達減少。TTF-2在12、13、14 d的表達差異有統計學意義(P＜0.05)，胚胎15 d時，已不能檢測到 TTF-2表達，這與15 d腭突上皮開始分化相一致，此時口腔腭突上皮分化為復層鱗狀上皮，鼻腔分化為假復層纖毛柱狀上皮。

3.3 小鼠腭突發育過程中TGFβ3表達的時空性 TGFβ3-/-小鼠和人TGFβ3突變均可引起腭裂，TGFβ3在腭突中嵴上皮細胞的黏附過程中起重要作用。我們研究結果顯示:在腭突形成時(胚胎12 d，E12 d)腭突中嵴上皮未檢測到TGFβ3表達。但當腭突上抬呈水平方向生長時(E13d)，首次在腭中山嵴上皮細胞中發現TGFβ3表達，隨著兩側腭突接觸、黏附、融合(E14 d)，TGFβ3在腭中嵴上皮中的表達最明顯，當腭突融合完成后(E15 d)，TGFβ3在腭中嵴上皮中表達減少。在腭突發育過程中，間充質細胞中未見TGFβ3表達。組織學觀察發現，小鼠胚胎13 d時，腭中嵴上皮表層細胞開始出泡，形成絲狀偽足，增加了細胞表面積為兩側腭突腭中嵴上皮細胞黏附作準備。小鼠胚胎14 d時，兩則腭中嵴上皮細胞相互插入形成細胞間黏附，小鼠胚胎15 d，兩側腭突融合完成。腭突發育的這些形態學改變與TGFβ3表達變化及其功能是相吻合的。

Pelton等［6，7］研究 TGFβ3主要分布在腭突中嵴上皮細胞，在間充質中也有少量分布，而本研究在13、14、15 d胚胎腭突中嵴上皮細胞中發現TGFB3表達與其研究結果相同，而未在間充質細胞中發現，這一點與他們研究略有不同。

3.4 TGFβ3和TTF-2的相互作用對小鼠腭突發育的影響TGFβ3和TTF-2兩種細胞因子均與腭突中嵴上皮細胞的分化轉歸相關。我們觀察到在腭中嵴上皮細胞中TGFβ3的出現較TTF-2延遲1 d，二者均在表達后一天出現峰值，TTF-2的表達變化對TGFβ3表達高峰的出現是有影響的。在腭突上抬為水平方向(E13d)，TTF-2表達達高峰，表現為強烈抑制腭中嵴上皮細胞分化，使腭中嵴上皮由2層轉為一層，便于兩側腭中嵴上皮細胞相互插入。此時由于TGFβ3的出現，腭中嵴上皮細胞表面出泡，形成絲狀偽足，當兩側腭突接觸時(E14d)，TTF-2表達急劇下降，解除對TGFβ3表達抑制，使其表達達高峰，有助于此時部分腭中嵴上皮細胞向間充質細胞轉化，另一方面促進兩側腭中嵴上皮細胞黏附。

TGFβ3-/-鼠和titf-2-/-鼠均可出現腭裂，筆者推測二者的協調一致，可能是促使腭突正常融合必要條件，而這種平衡一但受干擾(無論外源性或內源性)則有可能引起腭突發育障礙最終導致腭裂。

1 De Felice M，Ovitt C，Biffali E，et al.A mouse model for hereditary thyroid dysgenesis and cleft palate.Nat Genet，1998，19:395-398.

2 Clifton-Bligh RJ，Wentworth JM，Heinz P，et al.Mutation of the gene encoding human TTF-2 associated with thyroid agenesis，cleft palate and choanal atresia.Nat Genet，1998，19:399-401.

3 Castanet M，Park SM，Smith A，et al.A novel loss-of-functionmutation in TTF-2 is associated with congenital hypothyroidism，thyroid agenesis and cleft palate.Hum Mol Genet，2002，11:2051-2059.

4 黃磊，石冰，孫晉虎，等.地塞米松對體外培養A系小鼠腭突腭中嵴上皮融合的影響.華西口腔醫學雜志，2005，23:103-105.

5 Zannini M，Avantaggiato V，Biffali E，et al.TTF-2，a new forkhead protein，shows a temporal expression in the developing thyroid which is consistentwith a role in controlling the onset of differentiation.EMBO J，1997，16:3185-3197.

6 Pelton RW，Hogon BLM，Miller DA，etal.Differential expression of genes encoding.TGFs beta1，beta2，and beta3 during murine Palate formation Dev Biol，1990，141:456-460.

7 Lidral AC，Murray JC，Beutow KH，et al.Studies of the Candidates genes TGFB2，MSX1，TGFA，and TGFB3 in the etiology of cleft lip and palate in the Phillipines.Cleft Palate Craniofac J，1997，34:1-6.