不同濃度HAES在正常人體外對IL-10和IL-12的影響

胡萬寧 甘建輝 毛瑞英 孫桂苓 宋雨婷 劉秀立 王春立 陳東

隨著血漿代用品的應用日益廣泛，研究表明，羥乙基淀粉類血漿代用品(HAES)對體內抗腫瘤免疫系統無不良影響［1］，并且術前輸注羥乙基淀粉能有地減輕手術和麻醉導致機體免疫系統功能的抑制［2］。但血漿代用品用于非惡性腫瘤患者的研究國內外報道亦少見。本試驗試圖研究賀斯對健康者血液中免疫系統細胞因子在體外的影響，以檢驗其是否抑制健康者的免疫系統。為羥乙基淀粉類血漿代用品的臨床應用提供更廣泛的理論及試驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年3至12月河北省唐山市人民醫院健康志愿者30例，其中男18例，女12例;年齡25～40歲。在嚴格無菌的條件下，分別抽取靜脈血20ml入無菌試管，并以肝素抗凝，待用。在超凈臺內分離出單個核細胞，計數后將細胞平均分成5組:1640培養液陰性對照組、10%血漿對照組、10%賀斯試驗組、20%賀斯試驗組、40%賀斯試驗組，然后再將各組分成陰性對照組、加脂多糖(LPS)、加植物血凝素(PHA)，使單個核細胞在不同的培養液中培養48 h后，1 500 r/min離心5 min后汲取上清液，待檢測。

1.2 試驗方法 應用晶美生物工程(深圳)試劑盒行雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA法)檢測各上清液中細胞因子IL-10和IL-12和的濃度。雙抗體夾心ELISA法(以IL-12為例):抗人IL-12單抗包被于酶標板上，標本/標準品中的IL-12與單抗結合，游離成分被洗去。同時加入辣根過氧化物酶標記的親合素和生物素化的抗人IL-12抗體，生物素與親合素特異性結合，抗人IL-12抗體與結合在單抗上的人IL-12結合形成免疫復合物，未結合部分被洗去。加入顯色劑，若反應孔中有IL-12，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑呈現藍色，加終止液變黃。在450 nm處測OD值;IL-12濃度與OD450值呈正比，通過繪制標準曲線可求出標本中IL-12的濃度。以標準品濃度作橫坐標，OD450值作縱坐標，應用統計軟件SPSS 10.0繪制標準曲線。據曲線函數值計算各標本的濃度值。

1.3統計學分析應用SPSS10.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在不刺激淋巴細胞克隆的情況下，HAES各組與對照組的IL-10及IL-12濃度雖稍有參差，但差異無統計學意義(P＞0.05);應用LPS及PHA分別刺激B淋巴細胞、單核巨噬細胞和T淋巴細胞的克隆后，差異有統計學意義(P＞0.05)。組內比較:不刺激淋巴細胞克隆與應用LPS及PHA分別刺激B淋巴細胞、單核巨噬細胞和T淋巴細胞克隆的IL-10及IL-12濃度兩兩比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1、2。

表1 5組IL-10水平比較n=30，pg/m l，±s

表1 5組IL-10水平比較n=30，pg/m l，±s

注:與陰性對照比較，*P ＜0.05;與LPS比較，#P ＜0.05

組別 陰性對照LPS PHA 1640組 101±46 264±60* 481±90*#10%血漿組 150±46 303±66* 510±101*#10%血代組 139±41 297±60* 499±85*#20%血代組 129±34 278±50* 480±68*#40%血代組 134±40 271±66* 473±80*#

表2 5組IL-12水平比較n=30，pg/m l，±s

表2 5組IL-12水平比較n=30，pg/m l，±s

注:與陰性對照比較，*P ＜0.05;與LPS比較，#P ＜0.05

組別 陰性對照LPS PHA 1640組 93±41 233±81* 435±40*#10%血漿組 115±35 251±43* 457±75*#10%血代組 109±25 252±60* 472±65*#20%血代組 108±17 251±36* 450±45*#40%血代組 104±46 242±97* 439±62*#

3 討論

目前以羥乙基淀粉糾正大手術的低血容量、血液稀釋、改善血液流變學等已廣泛應用于臨床，成為一種減少異體輸血的有效方法［3，4］。除補充容量外，常作為自體輸血和血液稀釋的一種替代物。相對于它的前兩代，賀斯不僅能增加血漿容量、改善心排血量和體內的氧運輸，改善創傷或血容量不足患者的器官功能和全身血液動力學狀態，而且維持容量效應的時間較長，降解迅速，在體內存留時間短，可避免凝血機制的損害［5-7］。

合成培養基是按人和動物體內細胞所需成分模擬合成的、配方恒定的一種較理想的培養基。細胞生活在合成培養基中健康透明，利于延長細胞在體外存活的時間。RPMI 1640是一種常用的培養液，其主要成分為氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和一些其他輔助物質。有絲分裂原(mitogen)來自植物蛋白或細菌產物，它能與多種細胞膜糖類及寡糖基分子結合，后者為促使有絲分裂原受體，結合后能促使細胞活化和誘導細胞分裂。LPS為一種有絲分裂原，在B淋巴細胞及單核巨噬細胞表面均有其受體，能選擇性的刺激B淋巴細胞和單核巨噬細胞克隆;PHA為另一種有絲分裂原，在T淋巴細胞表面有其受體，能選擇中分子性刺激T淋巴細胞克隆。

IL是一組由淋巴細胞、單核吞噬細胞和其他非免疫細胞產生的介導白細胞與其他細胞間相互作用的細胞因子。目前已經確認有23種不同的白介素，其重要作用是調節細胞生長、分化、促進免疫應答和介導炎性反應［8］。IL-10是18.7 kD酸性蛋白，主要由TH2、B細胞、單核細胞和肥大細胞等細胞產生，它可以抑制T細胞分泌IFN-γ和白介素-2(IL-2)，同時也可以抑制T細胞增殖作為炎性遞質的單核因子的產生，以及由T細胞亞群產生的細胞因子［9］。IL-12是一種分子量70～75 kD的糖蛋白。IL-12是發動細胞免疫的細胞庫。主要由單核吞噬細胞產生，具有促進B細胞合成分泌免疫球蛋白(Ig)及Ig類別轉換，促進細胞毒性T細胞(TC)、自然殺傷細胞、淋巴因子活化的殺傷細胞增殖分化，增強殺傷能力［10］。

本試驗結果顯示:1640培養液組明顯較其他組IL-10、IL-12濃度低，說明雖然1640培養液含有多種氨基酸、碳水化合物、維生素、無機離子及小牛血清，但其較人體內環境仍有一定的差距。試驗組與血漿組的濃度值較接近，但比較中發現10%的賀斯組與10%的血漿組的濃度值更近似。

其次，不刺激淋巴細胞克隆與應用LPS及PHA分別刺激B淋巴細胞和T淋巴細胞的克隆三種條件下，兩種細胞因子的濃度值迥然不同，又互有聯系:(1)在IL-10，血漿濃度測定范圍是(150 ±46)pg/ml，加 LPS后，濃度增至(303 ±66)pg/ml，為前者的2倍，這是由于加LPS后B淋巴細胞和單核-巨噬細胞克隆明顯增加，一方面直接增加IL-10的產生，另一方面增加其他細胞因子的釋放，并作用于T淋巴細胞，刺激其增殖與分化，間接增加IL-10的產生，導致了IL-10濃度的明顯提高;加PHA后，濃度增至(510±101)pg/m l，為前者的4～5倍，這是由于加用PHA后，可明顯促進T淋巴細胞的克隆增殖，使T淋巴細胞的數量明顯增加，因此導致IL-10產生顯著增加。然而，IL-10主要由活化的T淋巴細胞產生，因此導致了加LPS后IL-10的濃度變化不如加PHA的明顯。(2)在IL-12，血漿濃度測定范圍是(115 ±35)pg/ml，加 LPS 后，濃度增至(251 ±43)pg/m l，為前者的2倍，這是由于加LPS后B淋巴細胞和單核-巨噬細胞克隆明顯增加，一方面直接增加IL-12的產生，另一方面增加其他細胞因子的釋放，并作用于T淋巴細胞，刺激其增殖與分化，間接增加IL-12的產生，導致了IL-12濃度的明顯提高;加PHA后，濃度增至(457±75)pg/ml，為前者的4倍，這是由于加用PHA后，可明顯促進T淋巴細胞的克隆增殖，使T淋巴細胞的數量明顯增加，因此導致IL-12產生顯著增加。然而，IL-12主要由活化的T淋巴細胞產生，因此導致了加LPS后IL-12的濃度變化不如加PHA的明顯。

綜上所述，不刺激淋巴細胞克隆與應用LPS及PHA分別刺激B淋巴細胞、單核巨噬細胞和T淋巴細胞的克隆三種條件下，HAES各組與對照組中兩種細胞因子的濃度無顯著性差異，提示三個濃度的賀斯在體外環境中不影響免疫細胞的生存、克隆及細胞因子的產生，即:HAES在體外試驗中不抑制正常人體免疫系統機能。因而，HAES應用于手術患者圍術期以減少異體輸血、保護其免疫狀態是安全可行的。

1 高魯渤，楊麗，李錦城.輸血與輸羥乙基淀粉對人體T細胞亞群和細胞因子的影響.中華血液學雜志，2003，24:265-267.

2 袁世熒，姚尚龍.羥乙基淀粉溶液對手術患者血漿細胞因子的影響.臨床麻醉學雜志，2002，18:408-410.

3 Beyer R，Harmening U，Rittmeyer O，et al.Use ofmodified fluid gelatin and hydroxyethyl starch for colloidal volume replacement in major orthopedic surgery.Br JAnaesth，1997，78:44-50.

4 EgliGA，Zollinger A，Eifert B，et al.Effect of progressive haemodilution with hydroxyethyl starch，gelatin and albumin on blood coagulation.Br J Anaesth，1997，78:684-689.

5 莊心良，曾因明，陳伯鑾主編.現代麻醉學.第3版.北京:人民衛生出版社，2004.311.

6 Blaicher AM，Reiter WJ，Blaicher W，et al.The effect of hydroxyethyl starch on platelet aggregation in vitro.Anesth Analg，1998，86:1318.

7 Treib J，Haass A，Piclur G，et al.Bleeding complications can be avoided using hydroxyethyl starch with a low MW in vivo.Intensive Care Medicine，1999，23:60.

8 黃振國，陳婷梅.細胞因子檢測的方法及其臨床應用.中國檢驗醫學與臨床，2003，4:75-77.

9 Livasy CA，Moore D，Cance WG，et al.Focal adhesion kinaseoverexpression in endometrial neoplasia.Appl Immunohistochem Mol morphol，2004，12:342-345.

10 甘建輝，陳杰，李峰，等.依托咪酯和丙泊酚麻醉對乳腺癌根治術患者圍術期血漿細胞因子的影響.第四軍醫大學學報，2008，29:封3-01.