葡萄糖和胰島素對4T1腫瘤細胞IL-6 mRNA表達的影響

孫鳳娥 劉玉霞 許鄭林 胡潔

近年來，糖尿病和乳腺癌的關系受到廣泛關注。大量研究顯示，糖尿病患者發生乳腺癌的危險顯著增加，糖尿病與乳腺癌的發生發展密切相關［1］。白介素-6(IL-6)是一種多效性細胞因子，對惡性腫瘤的發生發展及預后具有重要意義。目前有關葡萄糖和胰島素對4T1腫瘤細胞分泌IL-6的影響，尚未見相關研究報道。本實驗體外檢測不同濃度的葡萄糖和胰島素對4T1腫瘤細胞IL-6 mRNA表達的影響，為分析糖尿病與乳腺癌發生發展的關系提供實驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 實驗用腫瘤細胞株為小鼠乳腺癌細胞株(4T1腫瘤細胞，河北醫科大學免疫學教研室凍存);IL-6、βactin引物(上海生工生物工程公司合成);Prime Script PT reagent Kit反轉錄反應試劑盒(寶生物工程有限公司);PCR擴增試劑TaKaRa TaqTM(寶生物工程大連有限公司)。

1.2 4 T1 腫瘤細胞培養 4T1腫瘤細胞復蘇后，以2×105/ml的濃度接種于RPMI 1640培養基(其中含10%的胎牛血清，100 U/m l的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素)中，置于 37℃、5%CO2的培養箱培養，24～48 h換液1次，當細胞生長至90%以上時進行傳代。

1.3 實驗分組 取對數生長期的4T1腫瘤細胞進行分組實驗。根據培養液加入葡萄糖和胰島素濃度的不同，將實驗所用細胞分為15組:A組(對照組)只加RPMI1640培養液(不含葡萄糖和胰島素);B組RPMI 1640培養液+5 mmol/L葡萄糖;C組RPMI1640培養液+10 mmol/L葡萄糖;D組RPMI 1640培養液+25 mmol/L葡萄糖;E組RPMI1640培養液+35 mmol/L葡萄糖;F組RPMI 1640培養液+5μU/ml胰島素;G組RPMI 1640培養液 +25μU/ml胰島素;H組 RPMI 1640培養液125μU/ml胰島素;I組 RPMI 1640培養液 +250μU/m l胰島素;J組RPMI 1640培養液+1.25μU/m l胰島素;K組 RPMI 1640培養液+5 mmol/L葡萄糖+5μU/m l胰島素;L組RPMI 1640培養液+5 mmol/L葡萄糖+125μU/ml胰島素;M組RPMI1640培養液+25mmol/L葡萄糖+125μU/ml胰島素;N組RPMI1640培養液+25 mmol/L葡萄糖+5μU/ml胰島素;O組RPMI 1640培養液+25 mmol/L葡萄糖 +1.25μU/m l胰島素。

1.4 細胞總RNA提取 取對數生長期的4T1腫瘤細胞以終濃度1.5×105/ml接種于 6 孔細胞培養板上，A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O 組均設雙復孔，每孔培養總量 3 m l，置37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱培養48 h。培養結束后收集細胞，提取細胞總RNA，用紫外分光光度計檢測OD260/OD280的比值以驗證RNA的純度，比值＞1.8時方可用于RT-PCR檢測。

1.5 cDNA合成及PCR反應 取總RNA 1μg，按逆轉錄試劑盒說明合成cDNA。β-actin和IL-6的引物經premier 5.0引物設計軟件設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。實驗中所用引物濃度均為10μmol/L。β-actin的擴增片段長度為 350 bp。上游:5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’，下游:5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’。IL-6 的擴增片段長度為582 bp:上游:5’-CACGGCCTTCCCTACTTCACA-3’，下游:5’-GGCATAACGCACTAGGTTTGCC-3’。

β-actin的擴增條件為:94℃預變性5 min;94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，擴增25個循環;72℃再延伸10 min。IL-6的擴增條件為:94℃預變性5 min;94℃變性1 min，59℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，擴增 35 個循環;72℃再延伸10 min。取擴增產物5μl于2%瓊脂糖凝膠上電泳，置于紫外透射儀下觀察并拍照。

1.6 凝膠電泳圖像分析 將凝膠電泳圖像輸入凝膠電泳圖像分析系統進行表達強度分析。結果判定以IL-6與內參照β-actin的PCR產物條帶灰度值之比(IL-6/β-actin)作為反映IL-6表達水平的相對指標。

1.7統計學分析應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以±s表示，多個樣本均數間比較用單因素方差分析，多個樣本均數間兩兩比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的葡萄糖對4T1腫瘤細胞IL-6 mRNA表達的影響 D、E組IL-6 mRNA的表達［分別為(0.90±0.17)和(0.91±0.16)］高于A組(0.47±0.06)，差異有統計學意義(P＜0.05);而B、C組IL-6 mRNA的表達［分別為(0.57±0.13)和0.60±0.18)］與A組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度葡萄糖組4T1腫瘤細胞IL-6 mRNA的表達Mar:DNA Marker

2.2 不同濃度的胰島素對4T1腫瘤細胞IL-6 mRNA表達的影響 F、G、H、I、J組4T1腫瘤細胞 IL-6 mRNA的表達［分別為(0.54±0.14)、(0.57±0.05)、(0.58±0.05)、(0.61±0.12)和(0.58±0.12)］與A組(0.473±0.06)比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖2。

2.3 不同濃度的葡萄糖和胰島素同時作用對4T1腫瘤細胞IL-6 mRNA表達的影響 M、N、O組IL-6 mRNA的表達［分別為(0.91±0.12)、(0.90±0.16)和(0.91±0.10)］均高于 A 組(0.47±0.06)，差異有統計學意義(P＜0.05);而K、L組IL-6 mRNA的表達［(0.58±0.18)和(0.61±0.19)］與A組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖3。

圖2 不同濃度胰島素組4T1腫瘤細胞IL-6 mRNA的表達Mar:DNA Marker

圖3 不同濃度葡萄糖和胰島素組4T1腫瘤細胞IL-6 mRNA的表達Mar:DNA Marker

3 討論

在2型糖尿病的自然病程中，血漿葡萄糖和胰島素濃度的變化貫穿于病程的始終。其中高葡萄糖血癥是2型糖尿病的典型特征。有資料顯示，糖尿病患者IL-6表達水平升高［2，3］，推測高血糖導致了胰島細胞、單核細胞、血管內皮細胞等分泌IL-6增加;陳思嬌等［4］發現，2型糖尿病患者血清IL-6水平高于健康對照組，而血糖控制良好者IL-6濃度與健康對照組無差異，相關分析顯示IL-6水平和胰島素濃度關系不大，但與血糖濃度呈顯著正相關;高濃度葡萄糖能促進IL-6的生成在體外實驗中也得到了證實。本實驗結果顯示:高濃度的葡萄糖能夠上調4T1腫瘤細胞IL-6 mRNA的表達;胰島素濃度的變化不影響4T1腫瘤細胞IL-6 mRNA的表達。與以往研究結果一致。提示在糖尿病整個病程中，IL-6分泌增多系由高葡萄糖血癥所致，胰島素濃度對IL-6分泌的影響較小。

IL-6由活化的單核巨噬細胞、T淋巴細胞、內皮細胞、胰島細胞等分泌，具有多種生物學活性。大量研究表明，惡性腫瘤的發生發展、侵襲轉移與體內產生的IL-6密切相關［5，6］。在對乳腺癌的研究中發現，IL-6在乳腺癌組織的表達明顯高于其在正常乳腺組織中的表達［7］;乳腺癌患者與健康女性相比，血清中IL-6濃度較高［8］;乳腺癌患者中IL-6血清水平升高是其預后不佳的標志［9］。現已闡明，IL-6可通過多種途徑產生腫瘤免疫抑制作用［10-12］:(1)能抑制抗原提呈細胞的抗原提呈功能;(2)能促使腫瘤細胞合成大量前列腺素E2(PGE2);(3)抑制T細胞和單核巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子(TNF);(4)促進抑制性細胞因子IL-10的產生，抑制IL-12的合成;(5)能拮抗TIL細胞的細胞毒性等。另外，IL-6能激活癌基因信號轉導途徑，致使細胞生存期延長，細胞增殖、分裂能力增強，與腫瘤發生發展密切相關。

結合本實驗結果推測，高濃度的葡萄糖能夠促進體內正常細胞和乳腺癌細胞IL-6分泌增加，進而發揮免疫抑制作用，與乳腺癌的發生發展有關。因此，對于糖尿病患者以及糖尿病伴有乳腺癌的患者，應該嚴格控制血糖，減少IL-6的分泌，以抑制乳腺癌的發生發展及轉移，進而改善生活質量，延長壽命。

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