阿德福韋聯合特異性樹突細胞疫苗治療慢性乙型肝炎抗病毒療效與Th細胞因子觀察

郭力紅 張歲 劉靜 李保欣 段衛 佟立新

慢性乙型肝炎(CHB)由于病毒持續復制及免疫功能紊亂使肝細胞不斷受損害，最終發展為肝硬化或肝癌。阿德福韋酯(adefovir dipivoxil，ADV)是通過競爭脫氧腺苷三磷酸底物，使乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)鏈終止而抑制病毒的復制［1］。CHB患者體內乙型肝炎病毒(HBV)持續存在不易清除的原因可能是機體免疫力低下，對感染的HBV形成免疫耐受所致［2］。患者免疫功能缺陷的重要原因之一是其外周血中樹突細胞(dendritic cell，DC)數量下降，表型不成熟，功能降低，無法有效呈遞HBV抗原肽，不能誘發有效的特異的體液免疫和細胞免疫應答，從而不能激活DC的抗原呈遞功能及IFN等Th1型因子的分泌，導致CHB患者Th1/Th2細胞間的失衡［3］。樹突狀細胞作為最強大的專職抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APC)，是體內唯一具有激活幼稚T淋巴細胞(native T lymphocyte)誘導初次免疫應答能力的APC，Th1/Th2的平衡在HBV感染人體后病情發展方向中起到決定作用，Th1細胞主要產生白介素2(IL-2)、IFN-γ等細胞因子，而Th2細胞主要分泌IL-4、IL-10等細胞因子，故觀察血清IFN-γ、IL-4細胞因子，研究HBV感染時Th1/Th2狀態對認識乙型肝炎發病、發展、預后和觀察治療效果均有積極意義。本文通過觀察CHB患者在應用ADV聯合特異性樹突細胞疫苗治療過程中，分析治療后抗病毒療效及Th細胞因子的變化，為聯合治療慢性乙肝提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2006年10月至2009年10月我肝病中心門診或住院慢性乙型肝炎患者32例，男28例，女4例;年齡18～64歲，平均年齡(36±11)歲。所有患者丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)均＞40 U/L，HBV-DNA均＞5.03log10。入選患者無其他病毒合并感染及嚴重并發癥，治療前6個月內未使用過任何抗病毒及調節機體免疫的藥物，全部獲得知情同意。診斷標準符合2000年修訂的“病毒性肝炎防治方案”［4］及2005年“慢性乙型肝炎防治指南”。

1.2 主要試劑與儀器 DC疫苗制備試劑:重組人粒-巨嗜細胞集落細胞刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白介素-4(rhIL-4)、1640培養液、鼠抗人CD40、CD83，購于河北博海生物工程有限公司，HBsAg購于中國預防醫學科學院病毒所。酶聯免疫吸附測定試劑:IL-4、IFN-γ抗體酶聯免疫檢測試劑盒均購于河北生物工程有限公司。儀器:二氧化碳(CO2)培養箱(Thermo Forma，美國)，倒置顯微鏡(Olympus，日本)，可在450 nm處進行計數的全自動酶標儀(Thermo，芬蘭)，37℃恒溫箱(SBHW-IV，北京)，可調多道移液器及槍頭(EPPENDORF，德國)，離心機(LD-25-2，北京)，振蕩混勻器(XW-80A，上海)。

1.3 方法 在無菌條件下抽取受試者外周靜脈血20 m l，肝素抗凝，在百級試驗室進行下面操作:0.9%氯化鈉溶液1∶1稀釋抗凝血，層加到淋巴細胞分離液2 000 r/min離心30 min，分離出外周血單核細胞并計數，用1640培養液洗2次，在加入含有體積分數150 ml人AB型血清的1640培養液完全培養基重懸細胞，以2×109/L的細胞濃度加入一次性6孔培養板中，于37℃ 50 ml/L CO2飽和濕度下培養4 h，吸棄上清液，再用1640培養液輕洗2次，除去非貼壁細胞，加入含8 335μkat/L rhGMCSF和8 335μkat/L rhIL-4的完全培養基，隔日換液，培養至第6天再加入終濃度為2.5 mg/L的HBsAg，4 h后加入終濃度為10μg/L的 TNF，繼續在37℃ 50 ml/L CO2飽和濕度下培養1 d，收獲DC用0.9%氯化鈉溶液洗滌2次并計數，即刻在受試者腋下部位常規消毒后經皮下注入體內。同時取細胞洗液做無菌實驗。回輸2次為1個療程(間隔周)，共治療3個療程。1.4 檢測指標 留取患者治療前及治療過程中的血清，凍存于-86℃冰箱，分別檢測治療前及治療過程中各項指標。

1.5統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢性乙肝患者肝功能、HBV-DNA在治療過程中的變化ALT和AST從治療4周末有明顯改善(P＜0.05)，AST到12周末達正常范圍，ALT到48周末達正常范圍。HBV-DNA從治療12周末起即有明顯改善(P＜0.05)，在治療12周末、24周末改善值明顯升高(P＜0.05)，在48周末病毒陰轉。見表1。

2.2 IFN-γ、IL-4在治療過程中的變化 IFN-γ水平在12周末、24周末明顯高于治療前(P＜0.05)，IL-4水平在12周末、24周末明顯低于治療前(P＜0.05)。見表2。

表1 治療前后肝功能ALT、AST、HBV-DNA變化n=32，±s

表1 治療前后肝功能ALT、AST、HBV-DNA變化n=32，±s

注:與治療前比較，*P＜0.05

指標 治療前 治療4周 治療12周 治療24周 治療48周ALT(U/L) 132±48 70±25* 48±15* 46±16* 35±10*AST(U/L) 85±23 70±25* 31±9* 28±7* 29±8*DNA(log10) 6.4±0.8 5.8±0.8 4.9±0.9* 3.9±0.7* 2.8±0.8*

表2 IFN-γ、IL-4在治療前及治療過程中的變化n=32，±s

表2 IFN-γ、IL-4在治療前及治療過程中的變化n=32，±s

注:與治療前比較，*P＜0.05

指標 治療前 治療4周 治療12周 治療24周 治療48周IFN-γ 39±9 39±9 55±12* 58±12*39±8 IL-4 371±45 377±50 287±48* 282±55*371±47

3 討論

慢性乙型肝炎是嚴重危害我國人民健康的常見傳染病，全球有約4億人患CHB［5］，約30%的肝硬化和50%的肝細胞癌發病與之有關［6］，給個人、家庭和社會造成沉重負擔。國內外對CHB治療已有較大的進展，其中抗病毒治療是最主要、最根本的措施［7］。

阿德福韋酯口服后經過體內非特異性酯酶水解，迅速轉化為阿德福韋，阿德福韋是一種無環單磷酸脫氧腺苷類似物，被細胞內普遍存在的激酶磷酸化生產二磷酸阿德福韋。二磷酸阿德福韋和脫氧腺苷三磷酸(dATP)與多聚酶結合位點競爭性結合，從而抑制HBV-DNA，多聚酶、人免疫缺陷病毒(HIV)逆轉錄酶、對拉米夫定耐藥的HBV-DNA多聚酶活性，還可與腺苷酸競爭性摻入病毒DNA鏈，終止DNA鏈合成以抑制病毒復制［8］。國外研究顯示，ADV可有效抑制HBV復制，不僅對野生株有良好的抑制作用，對YMDD變異株也有明顯抑制作用，持續降低HBeAg陽性和HBeAg陰性的YMDD變異患者血清HBV-DNA和ALT水平，使患者獲得病毒學，肝臟生化功能和組織學的改善［9，10］。

DC是機體免疫應答的主要啟動者，在免疫應答的誘導中發揮關鍵的作用。DC的主要作用是提呈抗原，而只有成熟的DC才具有提呈抗原的能力，DC的不成熟是導致免疫耐受的原因之一。研究發現，慢性乙型肝炎患者的樹突狀細胞存在成熟及功能異常，其功能缺陷將導致抗原無法被有效地提呈給CD+4輔助性T淋巴細胞(Th)，從而導致其激活特異性抗病毒免疫反應，特別是細胞免疫反應的能力低下［11］。通過體外特異性抗原刺激DC，進而活化細胞毒性T淋巴細胞可達殺傷HBV感染的宿主細胞的作用。輔助性T淋巴細胞是調節機體免疫反應的關鍵細胞，Th1主因分泌IFN-γ等細胞因子，引起細胞免疫應答，Th1細胞占優勢，發生急性自限性感染和HBV清除。Th2則主因分泌IL-4等細胞因子，引起體液免疫應答，而Th2細胞占優勢，發生持續的慢性HBV感染，持續Th2型細胞因子分泌不利于病毒的清除，HBV感染致Th1/Th2細胞失衡，從而使Th1主導的細胞免疫功能受到抑制［12］。IL-4和IFN-γ之間的平衡對于Th0分化為Th1或Th2起關鍵調控作用，外源性IL-4可使CD+4前體細胞向Th2效應細胞分化，而IFN-γ則對前體細胞向Th2分化過程起抑制作用［13］。有學者報道在CHB患者抗病毒治療過程中，隨著HBV-DNA水平的下降，伴有IL-4水平的下降和IFN-γ水平的增加［14］。DC有效地激發T細胞活化，為慢性乙型肝炎免疫治療開辟了一條新途徑。本研究發現HBV-DNA改善值從4周末改善，在12、24周末明顯改善，IFN-γ水平在治療12周末明顯升高，在治療24周末達高峰，提示IFN-γ水平上升速度與HBV-DNA病毒載量下降速度相關。IL-4水平在治療過程中逐漸下降。在治療中可檢測到血清IFN-γ水平上升和IL-4水平下降，提示聯合治療可以促進更多的Th1型細胞因子分泌，以利機體抗HBV免疫的恢復或增強，為清除病毒創造條件。

本研究提示，ADV聯合特異性樹突細胞疫苗在治療過程中，不僅能抑制乙肝病毒的復制，而且能調動機體的免疫反應，打破機體的免疫耐受，恢復T細胞功能。本文探討了阿德福韋聯合特異性樹突細胞疫苗治療過程中機體免疫細胞功能的動態變化，表明聯合治療可直接抑制HBV-DNA合成，還可作為免疫調節劑，一定程度上改善CHB患者細胞因子的功能活性。在CHB治療過程中，細胞因子水平檢測可以作為血清學應答的一項監測指標，并且細胞因子有望成為抗病毒治療的手段［15］。通過細胞因子調節，使Th2向Th1偏移，有利于機體的免疫應答清除病毒，可作為設計治療CHB的策略。

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