瘦素對體外三維培養大鼠關節軟骨細胞的作用及對軟骨修復相關基因IGF-Ⅰ表達的影響

王舒新 李勇

瘦素為正處在研究階段的對關節軟骨的損傷修復可能有積極作用的藥物。本研究旨在構建藻酸鹽-軟骨細胞三維培養體系的基礎上，研究瘦素對軟骨細胞及其細胞外基質的影響，并探討其相關基因表達的變化，以期為軟骨損傷和退變尋找一種新的治療手段。

1 材料與方法

1.1 材料 軟骨細胞取自2只健康4周齡Sprague-Dawley大鼠(購于北京維通利華實驗動物技術有限公司)膝關節，體重(100±15)g，雌雄不限，清潔級。

1.2 主要試劑 胎牛血清(天津血研所)，DMEM培養基、胰蛋白酶(Sigma公司)，青霉素、鏈霉素(華北制藥有限公司)，膠原酶Ⅱ(Sigma公司)，SABC試劑盒(博士德公司)，胰酶(Gibco公司)，海藻酸鈉粉劑(Fluka公司)。

1.3 SD大鼠的軟骨細胞分離及擴增 取4周大鼠膝關節軟骨，剪成＜1mm3大小，經0.25%胰酶消化后加入0.2%Ⅱ膠原酶5 ml、37℃恒溫水浴振蕩箱下消化60～90 min，離心后，收集骨髓中的單個核細胞，接種于25 cm2培養瓶中，3 d后換液，此后每2～3天換液。倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況。待原代細胞達80%融合后，用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶2傳代。

1.4 軟骨細胞的鑒定 軟骨細胞呈星形、多角形，鋪路石樣生長;HE染色觀察軟骨細胞形態，Ⅱ型膠原免疫組織化學檢測方法觀察軟骨細胞中Ⅱ型膠原分泌情況。

1.5 與海藻酸鈉結合成軟骨-藻酸鈣復合體 將P2代細胞消化離心收集，使用低黏滯度的海藻酸鈉溶液懸浮細胞，調整細胞密度至5×106/ml，充分混勻。軟骨細胞/海藻酸鈉混合物在102 mmol/L CaCl2中聚合約15 min形成固體小珠(圖1)，于完全培養基中培養，加入不同濃度瘦素，依據培養液中不同濃度瘦素(0、1、10、100、1 000 ng/ml)分為 A、B、C、D、E 共5 組，將海藻酸鈣珠置于5%CO2飽和濕度、37℃培養箱中培養，每日或隔日換液。分別于培養24 h取海藻酸鈣凝珠進行以下檢測:(1)MTT檢測法檢測細胞活性;(2)Realtime PCR定量研究IGF-ⅠmRNA表達，分析評價軟骨細胞分泌的功能。

圖1 軟骨細胞/海藻酸鈣凝珠

1.6統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態 剛提取的軟骨細胞懸液，在倒置顯微鏡下觀察為很多“星星”狀的亮點;原代軟骨細胞24 h后開始逐漸貼壁，輕搖培養瓶，細胞仍固定于瓶底;軟骨細胞形態呈卵圓形貼壁生長，個別軟骨細胞開始伸出偽足;48 h后，軟骨細胞貼壁數量逐漸增加，同時見有部分細胞分裂增殖;細胞培養7 d后，軟骨細胞長滿瓶底，呈鋪路石樣改變，融合達80% ～90%，軟骨細胞此時呈圓形、多角形、或星形生長。傳代后的2、3代軟骨細胞形態仍為的圓形、多角形或星形，并保持很強的立體感;而第4代后，軟骨細胞形態逐漸發生改變，呈長梭形，立體感減弱、，有少量類似成纖維樣細胞，至5、6代，梭形細胞明顯增多、類似成纖維細胞呈雜草狀排列。見圖2～5。

圖2 平面培養下2代軟骨細胞形態

圖4 平面培養下4代軟骨細胞形態

圖5 平面培養下5代軟骨細胞形態

2.2 HE染色 對2、3代軟骨細胞行HE染色，顯微鏡下觀察見，2代軟骨細胞貼壁生長，細胞呈星形、多角形、圓形，可見偽足伸出，細胞核為圓形，胞質內容豐富，紅染、著色較深。見圖6。

圖6 軟骨細胞(HE×100)

2.3 Ⅱ型膠原免疫組織化學染色 傳代軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組織化學染色均呈陽性表現，胞漿明顯呈棕黃色，細胞核則被染成淺藍色。第2、3代軟骨細胞胞漿Ⅱ型膠原免疫組織化學染色較深，第4代開始減弱、但仍呈陽性表現、局部可呈陰性表現，第5代顯著減弱。見圖7～10。

圖7 2代軟骨細胞Ⅱ型膠原(免疫組化×100)

圖8 3代軟骨細胞Ⅱ型膠原(免疫組化×100)

圖9 4代軟骨細胞Ⅱ型膠原(免疫組化×100)

圖10 5代軟骨細胞Ⅱ型膠原(免疫組化×100)

2.4 MTT檢測細胞活性 5組軟骨細胞的OD值分別為(0.104±0.004)、(0.114±0.003)、(0.207±0.009)、(0.160 ±0.002)、(0.143±0.005)，C組OD值最高，與其他各組比較差異均有統計學意義(P＜0.01)。

2.5 RT-PCR法檢測軟骨細胞IGF-Ⅰ的表達

2.5.1 mRNA抽提的驗證:核酸蛋白檢測儀:紫外可見光分光光度計檢測RNA濃度和純度，經檢測抽提的RNA純度較高，無蛋白質、DNA等雜質干擾。

2.5.2 擴增曲線和溶解曲線分析:所有樣本均可見S形擴增曲線;被檢測基因的擴增產物均呈明顯單一波峰，無明顯雜峰。2.5.3 RT-PCR法軟骨細胞IGF-Ⅰ的表達作用的測定:瘦素濃度在1～1 000 ng/ml時，對軟骨細胞表達IGF-Ⅰ均有明顯促進作用，與A組比較差異均有統計學意義(P＜0.01)，C組比值最高，與其他各實驗組比較均有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 三維培養下瘦素刺激軟骨細胞表達IGF-Ⅰn=5，△CT，±s

表1 三維培養下瘦素刺激軟骨細胞表達IGF-Ⅰn=5，△CT，±s

注:與A組比較，*P ＜0.01;與 B組比較，#P ＜0.01;與 C組比較，△P ＜0.01

組別 IGF-Ⅰ/GAPDH A組3.627±0.940 B組 6.697±0.132*C組 8.573±0.332*#D組 7.753±0.892＊△E組 5.752±0.149＊△

3 討論

瘦素(leptin)是由脂肪細胞分泌一種蛋白質類激素，能參與調節能量代謝、食欲和生長發育。近年來發現，人關節軟骨細胞有瘦素受體表達，較低濃度的瘦素可促進關節軟骨細胞增殖并可促進軟骨細胞外基質(Ⅱ型膠原和蛋白多糖)的合成［1］。我們前期研究發現［2］，在大鼠膝關節腔內注射低濃度瘦素，可以誘導軟骨細胞合成和分泌軟骨修復因子IGF-Ⅰ。Maor等［3］也發現，較低濃度的瘦素可以劑量依賴性的方式刺激軟骨細胞前體細胞區增寬，使得軟骨組織的整體體積增加，并使軟骨組織合成的硫酸軟骨素明顯增加。

本實驗中，通過對1～5代軟骨細胞分別行HE染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色后，比較得出2、3代軟骨細胞更加接近原代細胞可作為實驗用種子細胞;通過MTT法及RT-PCR法對不同濃度瘦素干預下的三維環境中大鼠軟骨細胞增殖情況及相關基因表達產物進行比較證實:與A組(空白組)比較，較低濃度的瘦素可以促進軟骨細胞增殖、活性及相關基因的表達(P ＜0.05)，這與Maor等［3］研究結果是一致的;同時還發現隨著瘦素濃度增加軟骨細胞活性及基因表達產物也有所上調，瘦素為濃度10 ng/m l時最高(P＜0.05)，然而當瘦素濃度繼續增加時，軟骨細胞活性及基因表達產物反而成下調趨勢;此外與平面培養比較，軟骨細胞增殖、活性及相關基因的表達都有上升趨勢。本實驗結果說明:(1)瘦素可以促進軟骨細胞增殖、活性及相關基因的表達。機制可能是軟骨細胞表面存在長型瘦素受體表達，瘦素直接作用于該受體，通過JAK-STAT途徑激活從而刺激蛋白多糖和膠原合成［4］。然而隨著瘦素濃度繼續增加軟骨細胞活性及基因表達產物反而成下調趨勢，可能與高濃下產生的 JAK/STAT途徑抑制因子(如 SOCS-3、PTP1B、PIAS3)的數量增加有關［5-7］。這些機制還需要我們在今后的研究中進一步證實和完善。(2)與平面培養比較，軟骨細胞增殖、活性及相關基因的表達都有上升趨勢，原因可能是支架的應用使軟骨細胞的生存環境更接近體內環境，傳代的軟骨細胞仍能生長在其自身分泌的細胞外基質所形成的三維網狀空間中，這有利于較長的時間內保持軟骨細胞的表型及功能。我們研究最終目的是將體外培養的軟骨細胞回植，修復體內已被破壞的關節軟骨，而軟骨細胞的移植需要載體。理想的細胞移植載體應具備以下5個條件:(1)良好的組織相容性，載體材料對種子細胞和鄰近組織無免疫源性;(2)具有三維空間結構，載體材料必須是高度多孔的，從而具有很大的內表面積，這有利于細胞的植入和貼附及細胞因子的滲入;(3)載體具有良好的表面活性，有利于細胞的貼附，并為細胞在其表面生長增殖分泌基質提供良好的微環境;(4)生物可降解性和適度降解率，載體在組織形成過程中逐漸分解吸收，而不影響新形成組織的結構和功能，降解率應與組織生長率相適應;(5)載體材料可被加工成所需要的各種形狀，并有一定的機械強度，在植入體內后一定時間內仍可保持其形狀，使新形成的組織具有一定的外形［8］。本實驗選擇藻酸鈣凝膠支架是因為它除具備以上支架共同特點外，藻酸鈉在體內通過酶解作用分解，產物對人體無不良反應，食品和藥品管理局已批準藻酸鹽用于制作人類的食品添加劑及傷口敷料，而且與其他聚合物相比，價格低、來源豐富、易塑形、具有更好的親水性，易于細胞吸附，營養物質易于滲透。研究證實，成骨細胞成、纖維細胞和軟骨細胞可在藻酸鈣水凝膠中成活并形成細胞外基質［9］。

總之，海藻酸鈣凝膠組織工程材料，能夠滿足組織工程材料的要求，能與軟骨細胞完全嵌合，是一種良好的軟骨組織工程材料，瘦素又能進一步促進軟骨細胞增殖、活性及相關基因的表達，這些為下一步進行人類關節軟骨修復提供參考及依據。

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